自去年ASCO驚艷亮相后，近日拉羅替尼（larotrectinib，商品名Vitrakvi，文獻研究也稱LOXO-101）也經(jīng)FDA優(yōu)先審評后正式上市。這兩天，朋友圈都在熱傳其“廣譜”性（多癌種，17種以上）和高效性（客觀緩解率80%），但鮮有文章關注其用藥前的精準檢測。這里重點摘錄幾篇文獻的檢測方法及數(shù)據(jù)，結(jié)合我們的分析，提煉出以下關鍵點，供大家參考。

• 要點1

這是第一款TRK抑制劑（原肌球蛋白受體激酶，tropomyosin receptor kinase）被批準上市，其靶點是NTRK酪氨酸激酶區(qū)域，屬于TKI小分子藥物。NTRK是編碼TRK的基因，有NTRK1、NTRK2、NTRK3三位家族兄弟，分別位于染色體1q22、9q21、15q25不同區(qū)段，對應編碼的蛋白稱為TRKA、TRKB和TRKC。酪氨酸激酶區(qū)域都位于NTRK基因的3’端。伙伴基因與NTRK基因發(fā)生融合后，TRK融合蛋白將處于持續(xù)活躍狀態(tài)，引發(fā)信號級聯(lián)反應，從而驅(qū)動促進TRK融合腫瘤的擴散和生長。

如上圖，larotrectinib結(jié)構(gòu)式

如上圖：NTRK1/2/3表達的蛋白TrkA/B/C與下游信號通路形成級聯(lián)反應

如上圖，NTRK信號通路研究關鍵歷史（Nature Reviews, Vol15, 2018）

• 要點2

其“廣譜”性表現(xiàn)為只要NTRK基因與別的伙伴基因發(fā)生融合就是其適用靶標，可有效治療17種腫瘤類型（2017 ASCO報道）：肺癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、胃腸癌、結(jié)腸癌、軟組織肉瘤、唾液腺癌、嬰兒纖維肉瘤、闌尾癌、乳腺癌、膽管癌、胰腺癌。

如上圖，成人和兒童不同腫瘤NTRK陽性率

• 要點3

然而，雖然NTRK1/2/3在很多腫瘤中都可發(fā)生融合異常，但其總體陽性率實在太低了，還不夠1%。但在部分少見/罕見癌種中其陽性率還是相對較高的，其中大于25%的癌種（甚至可大于90%）有先天性嬰兒纖維肉瘤、唾液腺（乳腺樣）分泌性癌（MASC）、分泌性乳腺癌；而介于5-25%的癌種為乳頭狀甲狀腺癌、Spitz痣、先天性中胚層腎瘤、乳頭狀甲狀腺癌（放療照射后）、橋腦膠質(zhì)瘤（Pontine glioma）。而發(fā)病率大的腫瘤中其陽性率甚至還低于1%（如肺癌、結(jié)直腸癌）。需要注意，larotrectinib做臨床的NTRK陽性病例數(shù)也僅有55例（原始數(shù)據(jù)）和67例（補充數(shù)據(jù)）。

如上圖，NTRK各基因在不同癌種中的發(fā)生率

• 要點4

即便目前僅有100多例的陽性數(shù)據(jù)，但還是有很多東西可挖掘。這些陽性大多數(shù)為不同大小的NGS panel，為經(jīng)過CLIA認證的實驗室檢測出來的，比如其中有Foundation Medicine、Memorial Sloan Kettering Cancer Center和University ofWashington。55例陽性中用NGS檢出43例（78%）。

小部分為用FISH探針檢測出來的，且其中為部分用ETV6斷裂探針所代替（嬰兒纖維肉瘤中NTRK3-ETV6融合為特征性分子異常，ETV6有商品化探針，而與之融合的NTRK3卻沒有）。另外，文獻報道的NTRK1和NTRK2斷裂探針也多是研究者自己設計合成的，很少見有商品化的探針。

臨床試驗中也用Pan-TRK免疫組化來檢測TRKA、TRKB和TRKC的表達情況，用的是Abcam公司的兔單抗（克隆號EPR17341），在Leica Bond III機器上完成，抗原修復用的是BOND Epitope Retrieval Solution 2。

如上圖，Loxo Oncology公司在larotrectinib開展臨床試驗時的一份附件，用NGS、FISH、RT-PCR三種方法檢測都可接受，且描述了NTRK與伙伴基因融合的表述匯總

如上圖，Loxo Oncology公司說明在嬰兒纖維肉瘤的ETV6-NTRK3檢測中可用ETV6斷裂探針來替代

如上圖，一例高分化乳頭狀甲狀腺癌伴甲狀腺外淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生ETV6-NTRK3融合，但作者用的是ETV6斷裂探針來替代檢測

• 要點5

NTRK與不同伙伴基因融合也有一定的規(guī)律。在2018年8月31日Nature子刊ModernPathology發(fā)表的文獻”Molecular characterization of cancers with NTRK gene fusions”分析了11502例患者，其中31例（占比0.27%）為陽性。最常見的融合是ETV6-NTRK3（n=10）和TPM3-NTRK1（n=6）；膠質(zhì)瘤中NTRK融合陽性最多（14/982，1.4%），且最常見的為NTRK2（n=6）。而在上述55例原始數(shù)據(jù)中，ETV6-NTRK3融合占28例（51%），TPM3-NTRK1占9例（16%），LMNA-NTRK1融合占5例（9%），IRF2BP2-NTRK1融合占2例（4%），SQSTM1-NTRK1融合占2例（4%），且還有9種不同伙伴基因分別與NTRK1、NTRK2、NTRK3發(fā)生融合，例數(shù)都只有1例。

如上圖，11502例患者中NTRK1/2/3與不同伙伴基因融合的發(fā)生率匯總。需要注意：4073例肺腺癌中總共只有4例NTRK陽性，發(fā)生率極為之低

如上圖，NTRK1/2/3與不同伙伴基因融合，對larotrectinib治療的反應也有所差別

• 要點6

由于NGS在美國開展相對成熟、靈敏度相對FISH而言更高（可發(fā)現(xiàn)豐度較低的融合基因reads）、且進保險，而FISH探針NTRK1/2/3未有商品化探針、RT-PCR檢測這么多的融合伙伴基因很難實現(xiàn)，所以，雖然臨床試驗中寫了三種方法，但NGS的陽性比例占絕大比例（78%，43/55）。需要注意，附件中并沒看到不同豐度reads的融合對療效的影響如何。一般而言，NGS檢測需從FFPE或新鮮樣本中提取幾十ng以上的RNA，用于建庫及捕獲。

然而，不同大小的NGS panel往往需要設計RNA或DNA探針，來捕獲這三個基因，特別是較大的NTRK2和NTRK3基因（DNA片段分別長達39萬和35萬堿基對），外顯子較多，融合類型復雜且分布不一，且只能針對已知融合位點（序列）設計捕獲探針，成本較高，且不同廠家的panel性能可比性還有待積累。這些都是NGS技術用于NTRK1/2/3融合基因檢測的缺點。

而Loxo Oncology公司在官方網(wǎng)站上也羅列了10種NGS panel供參考。然而，在我們國內(nèi)，相關NGS獨立實驗室的panel性能還未見有較權威的驗證數(shù)據(jù)發(fā)表。

如上圖，Loxo Oncology公司推薦的10種NGS panel

• 要點7

針對NTRK蛋白的IHC檢測也見有一些文獻數(shù)據(jù)，但相對較少。以Abcam公司的pan-Trk兔單抗（克隆號EPR17341）發(fā)表的數(shù)據(jù)為主，見下圖Nature Modern Pathology文獻中的數(shù)據(jù)及討論。作者的IHC靈敏度為75%（且NTRK3陽性病例中45%為IHC假陰性），作者也提及Hechtman等人的靈敏度及特異性分別為95.2%和100%，Rudzinski等人的為97%和98%。不同作者有不同的結(jié)果，是否與所有機器、抗原修復方法等也有相關不得而知。Murphy等人認為TRK IHC有100%陰性預測值，但在IHC陽性表達病例中僅有9%為NTRK融合陽性?？赡躳an-Trk可用于NTRK融合基因的初篩，但有一定的漏診率（這篇文獻表現(xiàn)為NTRK1/2約為15%，NTRK3為45%）。當然，相對后續(xù)高昂的用藥費用而言，準確的檢測/診斷至關重要，有條件者肯定是需要做FISH或NGS來確診的。需注意：TRKA/B/C蛋白表達可見于胞漿、胞膜和胞核等不同位置，且有不同強度。

如上圖，TRKA/B/C蛋白表達的強度不一，位置多樣

• 要點8

講了這么多，輪到主角出場了：NTRK1/2/3 FISH探針！伙伴基因眾多，是NTRK設計為斷裂探針（一頭標紅，一頭標綠）的天然優(yōu)勢。且不管是與哪個基因融合，NTRK都可表現(xiàn)為紅綠分離的陽性信號，且可結(jié)合組織形態(tài)原位觀察、發(fā)現(xiàn)典型陽性類型之外的其他不典型信號（往往伴隨復雜易位或復雜核型）。在去年ASCO開始報道后，我們就著手開發(fā)了出來NTRK1斷裂探針、NTRK2斷裂探針和NTRK3斷裂探針，且可形成三個一起檢測的產(chǎn)品包（需要三張玻片）。產(chǎn)品代碼如下：

F.01103-01NTRK1（1q22-q23.1）基因斷裂探針

F.01289-01NTRK2（9q21）基因斷裂探針

F.01290-01NTRK3（15q25）基因斷裂探針

F.01348-01NTRK1/NTRK2/NTRK3探針

（自我表揚5秒鐘~~）

外周血培養(yǎng)中期染色體和樣本檢測圖如下：

• 要點9

需要注意，NTRK1/2/3斷裂探針的紅、綠端探針位置。NTRK1、NTRK2基因都是從左向右轉(zhuǎn)錄，5’在左邊，3’在右邊。NTRK3基因是從右向左轉(zhuǎn)錄，5’在右邊，3’在左邊。而我們的NTRK1斷裂探針、NTRK2斷裂探針和NTRK3斷裂探針都是左邊標記紅色，右邊標記綠色。

這是什么意思呢？如上面所述，NTRK基因是靠3’端帶有酪氨酸激酶區(qū)域的片段與伙伴基因發(fā)生融合，融合后導致TRK融合蛋白處于持續(xù)活躍狀態(tài)，引發(fā)信號級聯(lián)反應，從而驅(qū)動促進TRK融合腫瘤的擴散和生長。而酪氨酸激酶區(qū)域所表達的氨基酸段是larotrectinib的靶向區(qū)域，TRK融合蛋白含有酪氨酸激酶區(qū)域的氨基酸段，用藥才有效，否則無效。

所以，斷裂探針出現(xiàn)不典型陽性信號時，比如1綠1黃、1紅1黃，總之不是典型的1紅1綠1黃信號，我們就要分析了。NTRK1、NTRK2的3’端（右端）為綠色，出現(xiàn)1綠1黃時為不典型陽性（因為靠近3’端的酪氨酸激酶區(qū)域還存在）；而出現(xiàn)1紅1黃時為陰性（因為靠近3’端酪氨酸激酶區(qū)域的綠色區(qū)段缺失了，融合探針不表達酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，藥物無效）。而NTRK3斷裂探針因為紅綠端位置與NTRK1、NTRK2相同，但其5’和3’恰好反過來，所以情況與NTRK1/2恰好相反，1紅1黃為不典型陽性，1綠1黃為陰性。

當然，這是理論上分析的大概率事件，碰到具體樣本時也有可能恰好對應3’端缺失但酪氨酸激酶區(qū)域還在（雖然概率較低），而用藥有效。

總而言之，碰到這類不是典型1紅1綠1黃陽性信號表現(xiàn)為一定的比例（比如大于20%時），有條件者還是需要結(jié)合NGS分析或核型培養(yǎng)來相互驗證。

這類斷裂探針的信號點大小、紅綠探針間距與ALK、ROS1等斷裂探針類似，開展時可參考ALK、ROS1斷裂探針閾值15%，當然嚴謹?shù)淖龇ㄊ欠謩e取陰性樣本來做閾值建立。

如上圖，NTRK1/2/3可以不同的伙伴基因融合，都涉及到酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域區(qū)段；甚至在與RFWD2、STRN、EML4等基因融合時還涉及到Transmembrane domain區(qū)段。（Nature Reviews, Vol15, 2018）

如上圖，NTRK1斷裂探針1紅1黃陽性（3’為紅色）。假如此例樣本用我司探針的話則為1綠1黃陽性（3’為綠色）（Journal of Thoracic Oncology, 2015）

如上兩圖，判讀標準（3’單紅也算陽性），下b圖注意也伴有拷貝數(shù)增加異常。（Nat Med, 2014）

• 要點10

需要注意，2018年的Nature Modern Pathology這篇文獻顯示，有29%的NTRK融合陽性病例表現(xiàn)為單一的NTRK融合異常，并不伴有其他細胞遺傳學異常。這也提示為什么在部分病例中巨大腫物經(jīng)拉羅替尼治療后可明顯縮小，這就是靶向治療精準治療啊。

如上圖，全轉(zhuǎn)錄組分析顯示為單一的細胞遺傳學融合異常（只有ETV6-NTRK3融合）（Am J Surg Pathol 2016, 40:1051-1061）

• 要點11

由于NTRK1/2/3基因分別位于染色體1q22、9q21、15q25不同區(qū)段，三個靶標的其他信號異常（如多體、多紅、多綠等）提示其染色體核型或基因組可能比較復雜，且往往預后不佳，有條件者需結(jié)合NGS、核型分析進一步驗證。

如上圖，嬰兒纖維肉瘤，ETV6斷裂探針陰性，核型分析顯示復雜核型，且伴有EML4-NTRK3融合。（Cold Spring Harb Mol Case Stud, 2015）

如上圖，分泌性乳腺癌，ETV6-NTRK3融合并伴拷貝數(shù)增加。（J Clin Pathol 2009, 62:604-612）

• 要點12

雖然拉羅替尼剛剛被批準上市，但其耐藥機制已有研究，涉及到多個氨基酸位點的突變，這些只能用NGS方法來檢測了。

如上圖，TRKA/B/C蛋白的部分熱點突變。（Nature Reviews, Vol15, 2018）

• 要點13

需要注意，國內(nèi)已獲批準的克唑替尼（Crizotinib）的靶點不但是針對ALK、ROS1和MET，也可針對NTRK融合基因，其也是一種TRK抑制劑，只是與TRK的結(jié)合活性明顯比ALK、ROS1和MET低。（Nature Reviews, Vol15, 2018）

另外，Cabozantinib也可靶向MET、RET、AXL、TRKA和TRKB。Ponatinib最早是作為BCR-ABL1抑制劑，后來發(fā)現(xiàn)也可靶向NTRK融合蛋白；Nintedanib是抗血管生成藥物（VEGFR TKI），但也可抑制PDGFR、FGFR和TRK激酶。

• 要點14

Larotrectinib和Entrectinib為第一代TRK抑制劑已有臨床研究及剛被批準上市，第二代的TRK抑制劑如LOXO-195、TPX-0005、ONO-5390556等藥物在體外研究中也顯示出良好的針對TRK耐藥突變位點的活性，并且在較低的藥物濃度范圍下就可其作用。Larotrectinib耐藥后，未來的TRK抑制劑也更值得期待。

部分引用文獻：

1: Gatalica Z et al. Molecular characterization of cancers with NTRK gene fusions. 2018, Modern Pathology.

2: Laetsch TW et al. Larotrectinib for paediatric solid tumours harbouring NTRK gene fusions: phase 1 results from a multicentre, open-label, phase 1/2 study. www.thelancet.com/oncology Vol 19 May 2018.

3: Drilon A et al. Efficacy of Larotrectinib in TRKFusion-Positive Cancers in Adults and Children.2018, N Engl J Med, February 22.

4: Cocco E et al. NTRKfusion- positive cancers and TRK inhibitor therapy. 2018, Nature Reviews Clinical Oncology, Vol 15.