-中藥”網(wǎng)絡(luò)，以此探討人參促白虎湯解熱作用的可能機(jī)制。

1  發(fā)熱與免疫系統(tǒng)

發(fā)熱是機(jī)體通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)協(xié)同作用，以調(diào)節(jié)性體溫升高為特點(diǎn)的一種復(fù)雜的生理應(yīng)激反應(yīng)，主要由病原體感染（如細(xì)菌、病毒、真菌等）或者刺激（如細(xì)菌內(nèi)毒素、炎癥、損傷）引起。當(dāng)機(jī)體受到外源性致熱原侵襲，固有免疫細(xì)胞（單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等）細(xì)胞膜上Toll樣受體（Toll-likereceptors，TLRs）被激活，從而釋放致熱性細(xì)胞因子 [如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、γ干擾素（IFN-γ）等]，這些致熱性細(xì)胞因子不僅調(diào)節(jié)先天性和獲得性免疫應(yīng)答，還可直接或間接刺激大腦生成或釋放發(fā)熱性介質(zhì)如前列腺素E₂（PGE₂）等，引起發(fā)熱^[11-13]。來源于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的PGE₂是炎癥所致發(fā)熱過程中重要的中樞性正調(diào)節(jié)介質(zhì)，它可通過結(jié)合下丘腦視前區(qū)（POAH）神經(jīng)元上EP3受體，觸發(fā)交感神經(jīng)釋放去甲腎上腺素，誘導(dǎo)血管收縮以及棕色脂肪組織產(chǎn)熱增加而引起發(fā)熱^[14-17]（圖1）。另一種重要的內(nèi)源性致熱原是腫瘤壞死因子（TNF）。TNF由巨噬細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞等分泌，可能通過刺激環(huán)氧合酶合成，促進(jìn)PGE₂的生成^[18]，從而引起發(fā)熱。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）也可以調(diào)節(jié)機(jī)體發(fā)熱過程，其具體作用與和受體結(jié)合后誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）和促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）的生成有關(guān)^[19]。有研究通過脂多糖（LPS）激活垂體促皮質(zhì)激素細(xì)胞中IL-6/STAT3信號通路，發(fā)現(xiàn)垂體后葉中IL-6的表達(dá)與STAT3、NF-κB、ACTH呈共定位現(xiàn)象，該結(jié)果說明IL-6/STAT3參與了ACTH的表達(dá)^[20]，提示IL-6可以通過調(diào)控ACTH的表達(dá)來調(diào)節(jié)機(jī)體發(fā)熱過程。

TLRs是天然免疫重要的模式識(shí)別受體（pattern recognitionreceptor，PRR）^[21]，屬于I型跨膜蛋白，在識(shí)別病原體感染過程中發(fā)揮重要作用。迄今為止，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中共發(fā)現(xiàn)至少13種Toll樣蛋白受體^[22]，它們主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。TLRs被LPS激活，進(jìn)而激活巨噬細(xì)胞和誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟，分泌細(xì)胞因子（如IL-6、IL-1β、IL-10、TNF-α）^[23]。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4與細(xì)菌LPS具有高親和力^[24]。TLR4位于免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等）表面，MD2是細(xì)胞膜上的分泌蛋白，與TLR4胞外區(qū)結(jié)合形成TLR4-MD2復(fù)合物，LPS通過CD14分子和LPS結(jié)合蛋白（LBP）轉(zhuǎn)運(yùn)與TLR4-MD2復(fù)合物結(jié)合^[25]。一般認(rèn)為TLR4介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)有2種途徑：髓樣分化因子88（MyD88）途徑和TIR結(jié)構(gòu)域接頭分子（TRIF）途徑^[26]。含TIR域的銜接蛋白TIRAP介導(dǎo)MyD88依賴型途徑，Toll受體相關(guān)分子TRAM介導(dǎo)TRIF途徑^[27]。MyD88是髓樣細(xì)胞分化時(shí)表達(dá)的蛋白，活化的MyD88誘導(dǎo)IL-1受體相關(guān)激酶IRAKs磷酸化，進(jìn)而激活胞漿內(nèi)的TNF受體相關(guān)因子-6（TRAF-6），活化后的TRAF-6通過轉(zhuǎn)化生長因子-β激酶（TAK）與IκB激酶（IKK）信號級聯(lián)，使核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）抑制蛋白（IκB）磷酸化而降解，產(chǎn)生游離NF-κB，進(jìn)入細(xì)胞核誘導(dǎo)多種炎癥因子基因轉(zhuǎn)錄，如TNF-α、IL-1、IL-6等。TRIF途徑是由TRIF直

接招募激活TRAF-6，活化的TRAF-6可直接激活IKKs或TAK，再通過磷酸化的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）激酶（MKK）和IKKs，激活NF-κB和MAPK信號通路，釋放炎性細(xì)胞因子，最終導(dǎo)致機(jī)體發(fā)熱（圖1）。

2  人參增強(qiáng)免疫力的作用機(jī)制

2.1  人參與固有免疫細(xì)胞

巨噬細(xì)胞可以清除體內(nèi)衰老、損傷、凋亡的細(xì)胞和免疫復(fù)合物以及病原體等，激活固有免疫系統(tǒng)。研究表明人參皂苷能夠明顯促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，原因與增強(qiáng)巨噬細(xì)胞TLR4表達(dá)進(jìn)而增加小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬活性有關(guān)^[30]。人參寡糖也能顯著增加巨噬細(xì)胞吞噬能力，促進(jìn)NO、TNF-α和活性氧（ROS）產(chǎn)生，并且它通過上調(diào)一氧化氮合成酶的活性刺激NO生成^[31]。同時(shí)有研究用體外實(shí)驗(yàn)探討韓國紅參多糖對巨噬細(xì)胞活化作用的分子機(jī)制，研究結(jié)果顯示人參多糖能誘導(dǎo)NO生成和提高誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）、NF-κB、激活蛋白1（AP-1）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT-1）等mRNA水平，提示紅參多糖可能通過增強(qiáng)TLR2表達(dá)，活化NF-κB以及上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)酶（如ERK和JNK），從而激活巨噬細(xì)胞^[32]。綜上，人參可能通過激活TLR4或TLR2來激活巨噬細(xì)胞，從而激活固有免疫系統(tǒng)。

NK細(xì)胞是一種先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，參與第一道屏障，防御新產(chǎn)生的惡性細(xì)胞和被感染的細(xì)胞。有研究指出人參的水提物和醇提物均可顯著提高正常成年小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，提高NK細(xì)胞對L929細(xì)胞的殺傷率^[33]。人參皂苷Rb₁拮抗肝癌細(xì)胞抑制NK細(xì)胞免疫功能的實(shí)驗(yàn)表明，人參皂苷Rb₁具有提高NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力^[34]。有研究指出從人參根提取的低聚糖可以提高肝癌小鼠NK細(xì)胞活性^[35]，人參皂苷Rg₁也可以激活小鼠脾臟NK細(xì)胞活性^[36]。

樹突狀細(xì)胞（DC）是免疫系統(tǒng)最有效的抗原呈遞細(xì)胞，通過TLR識(shí)別病原體，是連接先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答之間的橋梁^[37]。研究顯示人參皂苷Rg₃可誘導(dǎo)外周血來源的DC成熟，促進(jìn)其功能轉(zhuǎn)變，并呈劑量依賴性^[38]。同時(shí)人參皂苷Rg₃聯(lián)合細(xì)胞因子可以將正常人單核細(xì)胞體外誘導(dǎo)成形態(tài)、表型和功能符合DC特征的細(xì)胞，可使單核細(xì)胞誘導(dǎo)DC產(chǎn)率增加，并提高其抗原呈遞功能^[39]。因此，人參可以通過促進(jìn)DC細(xì)胞產(chǎn)生、成熟和提高抗原呈遞能力來激活免疫系統(tǒng)。

2.2  人參與固有免疫分子

人參不僅作用于固有免疫細(xì)胞，對固有免疫分子的產(chǎn)生也有影響。固有免疫分子主要由細(xì)胞因子、補(bǔ)體、CD分子等組成。研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg₁和人參皂苷Re均能促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞增殖水平及提高IL-4、IL-19、IL-12和IFN-γ水平^[40]，作用機(jī)制可能與干擾LPS與TLR4受體的結(jié)合來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)^[41]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg₁也可以提高補(bǔ)體C3和C4的水平^[42]。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)人參提取物酸性多糖可以提高細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α）mRNA水平^[43]。在免疫應(yīng)答中，細(xì)胞因子如IL-2、IL-12、IL-18、TNF-α等，也可以通過影響NK細(xì)胞的分化、成熟、增殖和活化來調(diào)控其免疫學(xué)功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答^[44-46]。綜上所述，人參可通過調(diào)控細(xì)胞因子的生成與釋放，間接調(diào)控免疫系統(tǒng)。

3  應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測人參解熱作用機(jī)制

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路有2種：一是根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫對中藥活性成分信息、藥效及藥理作用等進(jìn)行文本挖掘，預(yù)測藥物作用靶點(diǎn)和疾病對應(yīng)的治療靶標(biāo)，并從生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度解析藥物作用機(jī)制；二是利用各種組學(xué)技術(shù)、高內(nèi)涵和高通量技疾病”網(wǎng)絡(luò)，建立預(yù)測模型，進(jìn)而解析所研究藥物的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制^[47]。本文通過文本挖掘預(yù)測人參解熱作用機(jī)制，其具體步驟見圖2。

3.1  藥物-疾病-靶標(biāo)數(shù)據(jù)收集及篩選

中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫包含中藥藥方、中藥材、藥材成分和化合物潛在靶標(biāo)等信息，常用的中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫有TCMID、TCMDatabase@Taiwan、TCMSP和TCMIP等^[48]。其中TCMSP數(shù)據(jù)庫包含了《中國藥典》收錄的499種中藥，以及從PubChem等數(shù)據(jù)庫收集與草藥相關(guān)的29 384個(gè)化學(xué)成分及其詳細(xì)的藥動(dòng)學(xué)信息^[49]。TCMSP數(shù)據(jù)庫也是一個(gè)全面研究中藥的分析平臺(tái)，可以用于有效成分鑒定、藥物靶點(diǎn)篩選和化合物靶標(biāo)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建^[50-52]。Liu等^[53]利用TCMSP數(shù)據(jù)庫，整合口服生物利用度（oralbioavailability，OB）篩選（≥40%）、藥物相似性評估（≥0.18）等信息來鑒定甘草生物活性成分及其潛在靶標(biāo)，其從甘草中鑒定了73種生物活性成分，并發(fā)現(xiàn)91個(gè)潛在的靶標(biāo)。

根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫用戶指南，按照OB≥30%、藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18的篩選條件對人參化學(xué)成分和人參腸道代謝物 [原人參二醇（PPD）、原人參三醇（PPT）、CK等]，以及其相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)行篩選，共篩選出人參22種活性成分（圖3）和可能的靶標(biāo)蛋白。再由HPO數(shù)據(jù)庫檢索得到編號為HP 0002373的發(fā)熱相關(guān)靶標(biāo)。

3.2  “人參-靶標(biāo)-發(fā)熱”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與機(jī)制預(yù)測

檢索得到人參活性成分靶標(biāo)和發(fā)熱相關(guān)靶標(biāo)后需要對二者相互作用關(guān)系進(jìn)行關(guān)聯(lián)，STRING數(shù)據(jù)庫常用于構(gòu)建“蛋白-蛋白”相互作用網(wǎng)絡(luò)^[54]。通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建“人參-靶標(biāo)-發(fā)熱”網(wǎng)絡(luò)，再由Cytoscape軟件將“人參-靶標(biāo)-發(fā)熱”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化（圖4）。此網(wǎng)絡(luò)由49個(gè)節(jié)點(diǎn)（表示蛋白質(zhì)）和126條線（表示蛋白與蛋白相互作用）組成，圓形節(jié)點(diǎn)代表人參活性成分預(yù)測靶標(biāo)，六邊形節(jié)點(diǎn)代表發(fā)熱相關(guān)靶標(biāo)。節(jié)點(diǎn)連接度、節(jié)點(diǎn)緊密度和節(jié)點(diǎn)

介度3個(gè)拓?fù)涮卣髦笜?biāo)用于評價(jià)節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中心性。圖4中的節(jié)點(diǎn)大小與節(jié)點(diǎn)連接度有關(guān)，節(jié)點(diǎn)連接度數(shù)值越大，則代表節(jié)點(diǎn)的圖形面積越大。

“人參-靶標(biāo)-發(fā)熱”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建后，利用Cytoscape軟件篩選出網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，再通過GATHER測算關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)潛在的分子機(jī)制。GATHER是常用的基因功能富集分析平臺(tái)，包含KEGG通路分析等^[55]。首先在Cytoscape軟件中設(shè)置節(jié)點(diǎn)連接度、節(jié)點(diǎn)緊密度和節(jié)點(diǎn)介度的值，使其值大于網(wǎng)絡(luò)中所有節(jié)點(diǎn)相應(yīng)特征值的中位數(shù)，找到“人參-靶標(biāo)-發(fā)熱”網(wǎng)絡(luò)中的18個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)（表1）。通過GATHER平臺(tái)對18個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析，測算出其主要可能的信號通路和靶點(diǎn)（表2）。

4  人參作用TLR信號通路促白虎湯解熱作用

GATHER平臺(tái)針對“人參-靶標(biāo)-發(fā)熱”網(wǎng)絡(luò)中的18個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行了基因功能富集分析，得到了9條信號通路。TLR在介導(dǎo)免疫與機(jī)體發(fā)熱中發(fā)揮重要作用。有研究用內(nèi)毒素及啤酒酵母誘導(dǎo)的發(fā)熱模型對人參皂苷Rg₃進(jìn)行了抗炎及解熱作用的研究，結(jié)果表明人參皂苷Rg₃具有一定的發(fā)汗、抗炎及解熱作用^[56]。因此，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，本文測算出人參促白虎湯解熱作用機(jī)制可能與人參作用于MyD88依賴型/MyD88非依賴型TLR信號通路激活免疫系統(tǒng)有關(guān)。

人參可調(diào)控TLR的表達(dá)來調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥和免疫反應(yīng)，達(dá)到解熱作用。研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb₁可抑制病毒誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激致小鼠急性肺損傷反應(yīng)過程中TLR4蛋白及TLR4mRNA的表達(dá)^[57]。Nakaya等^[58]通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，人參可通過TLR誘導(dǎo)前炎性細(xì)胞活素的生成，如TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ。已有研究通過人參皂苷Rg₁作用LPS刺激的小鼠巨噬細(xì)胞株RAW 264.7細(xì)胞，觀察其對TLR信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg_l對LPS刺激的TLR4及其下游通路的MyD88和TRAF 6有抑制作用^[59]。

已有研究報(bào)道白虎湯解熱作用機(jī)制可能與升高人體的血鈣濃度有關(guān)，而鈣離子可抑制產(chǎn)熱中樞、渴感中樞和出汗中樞，達(dá)到解除煩渴的效果^[60-61]，也有研究認(rèn)為其解熱作用可能與方中石膏所含的微量物質(zhì)和知母中的芒果苷有關(guān)^[62-63]。因此，在人參白虎湯中人參可能是通過作用于TLR信號通路激活機(jī)體免疫系統(tǒng)而發(fā)揮益氣生津、甘溫除熱功效，從而促其解熱；也有可能與人參白虎湯中其他成分的協(xié)同作用有關(guān)。

5  展望

中藥復(fù)方是中醫(yī)臨床應(yīng)用的主要形式。中藥復(fù)方和生物體均為復(fù)雜體系，欲探索二者相互作用的科學(xué)內(nèi)涵，必將涉及海量信息的處理。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以系統(tǒng)生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，應(yīng)用了高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索及計(jì)算機(jī)虛擬計(jì)算等，特別適用于中藥復(fù)方研究。本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，通過對人參主要成分靶點(diǎn)和發(fā)熱對應(yīng)靶標(biāo)的數(shù)據(jù)挖掘，構(gòu)建“人參-靶標(biāo)-發(fā)熱”網(wǎng)絡(luò)，并預(yù)測人參是通過作用于TLRs信號通路激活機(jī)體天然免疫系統(tǒng)來發(fā)揮促白虎湯解熱功效，后期擬通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，以期為扶正藥促解熱作用研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)（略） 

來  源：李  賽，朱晨晨，田雪飛，彭  蘭，張序晴，曾  嶸，王志琪. 應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討人參促白虎湯解熱作用的免疫學(xué)機(jī)制 [J]. 中草藥, 2018, 49(10):2460-2468.