阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種以認知、行為功能障礙為主要表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變^[1]。其病因尚不明確，病機假說有多種，如膽堿能系統(tǒng)功能障礙、Aβ毒性學(xué)說、Tau蛋白磷酸化學(xué)說、血清素激活的系統(tǒng)功能障礙、氧化應(yīng)激學(xué)說、細胞凋亡學(xué)說等^[2]。目前，針對其機制假說，D-天冬氨酸（NMDA）受體拮抗藥美金剛，但治療效果不理想。中藥及復(fù)方含有大量的化學(xué)物質(zhì)，可作用于疾病相關(guān)的多個靶點，對于AD這種多因素、

1  材料與方法

1.1  材料

件運行環(huán)境：Microsoft Windows 8 Home Basic操作系統(tǒng)。

1.2  方法

1.2.1  牛膝化學(xué)成分的收集及前處理  TCMSP數(shù)據(jù)庫可以用于有效成分鑒定、藥物靶點篩選和化合物靶標(biāo)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建^[5-6]。通過文獻調(diào)研與查閱

1.2.2  靶蛋白的收集及前處理  查閱有關(guān)AD發(fā)病機制的中外文獻，并收集DrugBank數(shù)據(jù)庫^[7]中與AD發(fā)病密切相關(guān)的靶蛋白。在PDB數(shù)據(jù)庫^[8]下載

1.2.3  牛膝化學(xué)成分與關(guān)鍵蛋白對接  利用Discovery Studio 3.5的cdocker模塊，將牛膝176個化學(xué)成分與靶蛋白進行半柔性對接，將SDS Site Sphere半徑設(shè)為9，Top Hit設(shè)為3，Pose Cluster Radius設(shè)為0.5，其他參數(shù)設(shè)置為默認值，打分函數(shù)選取?cdocker energy。

1.2.4  分子對接評價標(biāo)準(zhǔn)  通過查閱相關(guān)文獻，在Discovery Studio 3.5的cdocker模塊中，cdocker energy的值越低（即?cdocker energy越高），說明化學(xué)分子與蛋白受體對接體系越穩(wěn)定，對接結(jié)果越可靠^[9]。對接靶蛋白的數(shù)目越多，與靶蛋白相對應(yīng)疾病的關(guān)系越密切。故選定?cdocker energy≥0且作用靶蛋白數(shù)目≥5作為活性分子與AD關(guān)鍵蛋白靶點是否存在較強結(jié)合活性的評價標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5  網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)分子對接評價標(biāo)準(zhǔn)，得出牛膝治療AD的有效成分。通過查閱Uniprot數(shù)據(jù)庫，得到36個靶蛋白的基因名，并依據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫Mapper中的Search Pathway模塊，將篩選的靶蛋白進行通路富集，設(shè)置參與信號通路的靶蛋白數(shù)≥3且與AD發(fā)病機制相關(guān)^[10]，得到與AD相關(guān)的信號通路集。將牛膝有效成分、篩選的靶蛋白和通路信息導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1軟件中，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點（node）表示化合物、靶點以及作用通路，分子與靶蛋白、靶蛋白與信號通路之間的聯(lián)系則以邊（edge）相連。經(jīng)處理后，得到相關(guān)的分子-靶標(biāo)-通路富集圖，表示牛膝“成分-靶點-通路-AD”間的相互關(guān)系。

2  結(jié)果

2.1  對接可靠性驗證

將蛋白晶體結(jié)構(gòu)中的原配體位置作為參考，將原配體抽離出來，再重新對接回靶蛋白的活性口袋，將晶體結(jié)構(gòu)中的配體位置作為參考來計算對接得到的10個配體與其的RMSD值。若得到的RMSD值小于0.2 nm，說明此對接方法可靠。結(jié)果（表1）表明所選用的靶蛋白都較可靠，可用于虛擬篩選。

2.2  分子對接結(jié)果

通過Lipinski類藥性五原則和分子對接評價后，依據(jù)對接成功靶點數(shù)≥5且?cdockerenergy≥0共篩選出58個分子（表2），其中有57個分子與20個以上靶蛋白有強烈的相互作用，30個分子與30個以上靶蛋白有強烈的相互作用。

2.3  牛膝“成分-靶蛋白-通路”網(wǎng)絡(luò)

2.3.1  網(wǎng)絡(luò)特征分析  通過分子-靶蛋白網(wǎng)絡(luò)與靶蛋白-信號通路網(wǎng)絡(luò)基本屬性（表3）總體分析可得，牛膝中不僅有多個化合物作用于同一個靶蛋白，還有單個化合物作用于多個靶蛋白、多個通路，這正體現(xiàn)了牛膝中藥“多成分、多靶點、多通路”協(xié)同作用的特點。

2.3.2  化學(xué)成分分析  根據(jù)Lipinski類藥性五原則及與靶蛋白分子對接后結(jié)果分析，可以確定牛膝靶標(biāo)成分有58個。其中多為小分子烷烴（庚烷、葵烷、十四烷、十六烷、二十三烷等）、酯類化合物（鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、醋酸乙酯、棕櫚酸甲酯等）、羧酸類化合物（棕櫚酸、辛酸、琥珀酸、硬脂酸等）；其次為黃酮類（槲皮素、漢黃芩素、山柰酚、黃芩素）、蒽醌類（大黃酚）、香豆素類（海棠果素E）等化合物?；跇颖緮?shù)據(jù)復(fù)雜性與TCMSP數(shù)據(jù)庫用戶指南考慮，按照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18篩選條件對對接后活性成分進一步驗證分析，結(jié)果表明有6個化合物有較好的OB與類藥性，其中黃酮類化合物（槲皮素、漢黃芩素、山柰酚、黃芩素）具有較高的OB和DL值，且文獻報道這些化合物均具有治療AD的活性^[11-14]。在數(shù)據(jù)處理過程中發(fā)現(xiàn)蒽醌類化合物大黃酚^[15]雖然OB≤30%，但根據(jù)文獻調(diào)研，其對防治AD有藥理活性。此6個活性成分基本信息見表4。

2.3.3  化合物-靶蛋白網(wǎng)絡(luò)分析  如圖1所示，矩形代表牛膝活性成分，菱形代表活性化合物潛在靶點，如果多個活性成分都落在這個點上，則菱形就較大，圓形代表通路，每條邊則代表之間的相互作用關(guān)系。本研究建立的牛膝化合物-靶蛋白網(wǎng)絡(luò)是由58個活性分子及與之相連的36個靶蛋白構(gòu)成。在篩選后6個化合物中，具有文獻支持治療AD的5個黃酮和蒽醌類化合物約占總活性成分的8.6%，與潛在AD靶點的相互作用數(shù)大于20。此5個核心活性成分除了作用于Ca²⁺/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶IIα（CaMK-IIα）、CaMK-IIβ、CaMK-IIγ，凋亡類靶蛋白糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、Caspase-3、Caspase-7、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、蛋白激酶B1（Akt1）外，也都作用于熱休克蛋白70（HSP70），膽堿能系統(tǒng)功能蛋白乙酰膽堿酯酶（AChE）、丁酰膽堿酯酶（BChE），炎癥類靶蛋白腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、磷酸二酯酶4B（PDE4B），氧化應(yīng)激類靶蛋白血紅素氧合酶1（HO-1）、單胺氧化酶B（MAO B）、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPARγ），γ-氨基丁酸（GABA）系統(tǒng)功能類蛋白γ-氨基丁酸A型受體（GABAA）等。

2.3.4  靶蛋白-信號通路網(wǎng)絡(luò)分析  治療AD的36個靶蛋白在KEGG通路富集中，有23個靶蛋白（CaMK-IIα、CaMK-IIβ、CaMK-IIγ、Caspase-3、Caspase-7、Bcl-2、Akt1、GSK-3β等）能夠映射到治療AD相關(guān)的12條通路中，其中信號通路相對接蛋白約占總靶蛋白的64%。這12條通路包括胰島素信號通路（insulin signalingpathway）、Wnt信號通路（Wnt signaling pathway）、有絲分裂原激活的蛋白激酶通路（MAPK signalingpathway）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）等，說明靶點蛋白在不同通路間互相調(diào)節(jié)并進行信號傳遞。

3  討論

結(jié)合分子對接結(jié)果本實驗共篩選出58個牛膝化學(xué)成分，進一步根據(jù)OB和OL進行篩選，預(yù)測出牛膝中6個治療AD的活性成分，其中黃酮類（槲皮素、漢黃芩素、山柰酚、黃芩素）、蒽醌類（大黃酚）化合物有相關(guān)文獻報道，說明該研究方法的合理性。而海棠果素E缺乏文獻支持，故藥效學(xué)與作用機制需進一步驗證。

根據(jù)“化合物-靶蛋白”分子對接結(jié)果顯示，5個黃酮類和蒽醌類化合物都對接AD相關(guān)的靶蛋白共24個，其中CaMK-IIα、CaMK-IIβ、CaMK-IIγ，是腦組織中極其豐富的一種蛋白激酶，在學(xué)習(xí)、記憶中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，可通過影響tau蛋白過度磷酸化和淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）的磷酸化，進一步影響細胞內(nèi)的鈣離子濃度，激活蛋白激酶C和其他鈣離子依賴性蛋白激酶以發(fā)揮抗AD作用^[16]。凋亡類靶蛋白GSK-3β在AD病理發(fā)展中（如記憶障礙、tau蛋白磷酸化、小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥、炎性因子的釋放等）發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而Caspase-7、Caspase-3、Bcl-2可以激活由Aβ蛋白毒性導(dǎo)致的AD^[17]。另外，這些成分均相對接于HSP70蛋白，膽堿能系統(tǒng)功能蛋白AchE、BchE，炎癥類靶蛋白TNF-α、PDE4B，氧化應(yīng)激類靶蛋白HO-1、MAO B、PPARγ，GABA系統(tǒng)功能類蛋白GABA A等，預(yù)測牛膝活性成分可通過TNF-α、HSP70、Caspase-3激活MAPK激酶調(diào)節(jié)神經(jīng)元細胞的凋亡，減少氧化自由基的生成和增強抗氧化酶的活性，拮抗由興奮性氨基酸介導(dǎo)的神經(jīng)毒性，抑制乙酰膽堿酯酶活性等，進而有效的治療AD。

MAPK是一組脯氨酸依賴的蛋白激酶，參與了細胞增殖、氧化和凋亡等多種生理功能^[18]。MAPK signaling pathway在哺乳動物類細胞主要由p38 signaling pathway、ERK signaling pathway和JNK signaling pathway組成。由靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖可知，與MAPKsignaling pathway相接的靶蛋白有Akt1、Caspase-3、HSP70和TNF-α，主要與p38與JNK通路相關(guān)。p38與JNK都是應(yīng)激激活蛋白激酶， TNF-α會激活p38。p38是神經(jīng)炎癥機制的重要調(diào)控蛋白，在Aβ介導(dǎo)的氧化應(yīng)激時可促進炎癥因子的生成，加速誘導(dǎo)tau蛋白磷酸化，進而引起細胞的凋亡^[18]。研究表明，槲皮素^[19]、漢黃芩素^[20]、黃芩素^[21]和山柰酚^[22]可通過下調(diào)p38MAPK磷酸化，減少炎性反應(yīng)，抑制細胞凋亡。

靶蛋白CaMK-IIα、CaMK-IIβ、CaMK-IIγ、γ secretase和GSK-3β富集于Wntsignaling pathway中。β-catenin為Wnt下游的調(diào)控因子，研究表明Wnt/β- catenin signaling pathway可保護神經(jīng)元細胞，并調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子的濃度，防止鈣離子濃度增加進一步激活CaMK導(dǎo)致Tau蛋白過度磷酸化，抑制神經(jīng)元細胞的凋亡^[24]。據(jù)報道，黃芩素^[25]、漢黃芩素^[26]、槲皮素^[27]和山柰酚^[28]可通過激活Wnt/β-catenin signaling pathway使細胞再生。

PI3K-Akt signalingpathway與mTORsignaling pathway相互交叉，經(jīng)典mTORsignaling pathway由PI3K-Akt-mTORsignaling pathway多層次調(diào)節(jié)神經(jīng)元細胞發(fā)育、學(xué)習(xí)與記憶。在此通路中，Akt發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，Akt磷酸化可以正反饋地刺激mTOR signaling pathway活化，mTOR signaling pathway的活化對Akt有負反饋抑制作用^[29]。各種細胞因子可以使PI3K磷酸化，進而將2個Akt激酶磷酸化，引起Akt活化與細胞膜結(jié)合。mTOR是非經(jīng)典蘇氨酸/絲氨酸的蛋白激酶，也是Akt下游的靶點之一，不僅可以促進Aβ的形成，還通過調(diào)節(jié)Tau蛋白的3個磷酸化位點控制Tau蛋白的合成和聚集^[30]。據(jù)文獻報道，槲皮素^[31]、漢黃芩素^[32]誘導(dǎo)PI3K-Akt-mTOR signaling pathway蛋白的表達，促進細胞增殖。

Insulin signalingpathway受損也是AD發(fā)病機制之一，研究顯示^[33]AD患者患病早期會出現(xiàn)葡萄糖利用率降低，由于胰島素抵抗導(dǎo)致神經(jīng)元缺少糖分而能量不足。腦內(nèi)insulin signaling pathway減弱，不僅使腦內(nèi)p-Akt水平和PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下調(diào)，導(dǎo)致GSK-3β活性增強，tau蛋白過度磷酸化，還進一步導(dǎo)致神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFT）形成和神經(jīng)元細胞凋亡。KEGG“成分-靶蛋白-通路”富集網(wǎng)絡(luò)圖中，雖然出現(xiàn)insulin signaling pathway，但經(jīng)文獻檢索，暫未發(fā)現(xiàn)牛膝活性成分通過抑制胰島素代謝障礙來防治AD，說明其活性成分需要進一步實驗支撐。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對牛膝藥效成分進行靶標(biāo)預(yù)測和通路分析，通過建立藥效成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，多角度探索牛膝治療AD潛在的作用機制，發(fā)現(xiàn)牛膝中黃酮類和蒽醌類藥效成分可能通過抗細胞凋亡、抗氧化應(yīng)激、減少炎癥反應(yīng)等機制發(fā)揮抗AD作用，為其后續(xù)臨床試驗療效評價指標(biāo)的篩選提供依據(jù)和方向。同時，對于文獻中證明有治療AD作用的生物堿類、甾醇類化合物，本研究并未篩選得到，說明實驗方法還存在一些局限性，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果仍需要后續(xù)實驗的驗證與支持，并使其相關(guān)數(shù)據(jù)庫建設(shè)、算法創(chuàng)建、分子篩選依據(jù)等不斷完善。