N6-甲基腺苷（m6A）mRNA甲基化是影響發(fā)育和腫瘤中細(xì)胞分化和增殖的基因調(diào)節(jié)機(jī)制。為了研究m6A mRNA甲基化在細(xì)胞增殖和致瘤性中的作用，作者研究了人子宮內(nèi)膜癌，其中熱點(diǎn)R298P突變存在于甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物（METTL14）的關(guān)鍵組分中。作者發(fā)現(xiàn)大約70％的子宮內(nèi)膜腫瘤表現(xiàn)出m6A甲基化的減少，這可能是由于這種METTL14突變或甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的另一組分METTL3的表達(dá)降低。這些變化可能通過(guò)激活A(yù)KT途徑導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和致瘤性增加。 m6A甲基化的減少導(dǎo)致陰性AKT調(diào)節(jié)物PHLPP2的表達(dá)降低和陽(yáng)性AKT調(diào)節(jié)物mTORC2的表達(dá)增加?？傊@些結(jié)果揭示了m6A mRNA甲基化作為子宮內(nèi)膜癌中的致癌機(jī)制，并且m6A甲基化是AKT信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)因子。

N6-甲基腺苷（m6A）是人類(lèi)中最普遍的mRNA修飾。這種修飾是可逆的。由核心METTL3-METTL14 m6A甲基轉(zhuǎn)移酶和調(diào)節(jié)亞基組成的復(fù)合物催化mRNA的m6A甲基化。至少兩種酶FTO和ALKBH5介導(dǎo)這種甲基化的逆轉(zhuǎn)。m6A mRNA甲基化通過(guò)影響細(xì)胞分化期間的mRNA轉(zhuǎn)換來(lái)調(diào)節(jié)干細(xì)胞的自我更新和分化，并且在胚胎發(fā)育期間在轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)換中起關(guān)鍵作用。m6A mRNA甲基化在各種腫瘤中的起始和進(jìn)展的途徑中出現(xiàn)。

m6A mRNA甲基化影響干細(xì)胞和癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。然而，m6A甲基化如何影響細(xì)胞生長(zhǎng)以及哪些潛在的途徑和機(jī)制介導(dǎo)這些變化仍未完全闡明。在作者在子宮內(nèi)膜癌中研究了這個(gè)問(wèn)題，其中測(cè)序研究已經(jīng)確定了m6A甲基轉(zhuǎn)移酶亞基METTL14的高頻突變。與配對(duì)的正常子宮內(nèi)膜相比，約70％的子宮內(nèi)膜腫瘤表現(xiàn)出m6A甲基化降低。這些m6A甲基化的減少可能是由METTL14的突變或METTL3甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)降低引起的。這些結(jié)果表明m6A甲基化的體細(xì)胞突變是促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的重要因素，揭示m6A mRNA甲基化減少很可能是大部分子宮內(nèi)膜癌的致癌機(jī)制。

作者首先發(fā)現(xiàn)R298P熱點(diǎn)突變顯著降低了m6A甲基化復(fù)合物的RNA甲基化催化活性（圖1a）。 盡管過(guò)表達(dá)野生型METTL14促進(jìn)了HEC-1-A子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中細(xì)胞poly（A）RNA的m6A甲基化，但突變METTL14在過(guò)表達(dá)時(shí)似乎無(wú)活性（圖1b）。 雖然野生型METTL14的過(guò)表達(dá)降低了細(xì)胞增殖，但突變體的過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有明顯影響（圖1c），表明METTL14突變可能是一種表現(xiàn)為功能喪失的等位基因。與來(lái)自野生型鄰近正常組織的mRNA相比，來(lái)自三個(gè)突變腫瘤的mRNA具有降低的總體m6A甲基化（P = 0.04），表明METTL14（R298P）突變抑制腫瘤m6A mRNA甲基化（圖1d）。

圖1：METTL14突變和METTL3與m6A mRNA的關(guān)聯(lián)

與鄰近的正常子宮內(nèi)膜組織相比，所有腫瘤中約70％（包括大多數(shù)具有野生型METTL14的腫瘤）表現(xiàn)出總m6A mRNA甲基化減少（圖1e）。 作者通過(guò)RT-qPCR評(píng)估了腫瘤和鄰近正常子宮內(nèi)膜組織中m6A相關(guān)復(fù)合物的表達(dá)情況（圖1f）。作者發(fā)現(xiàn)METTL3表達(dá)減少與這些腫瘤組織中m6A甲基化的減少相關(guān)（圖1g）。 具有正常子宮內(nèi)膜和上皮子宮內(nèi)膜癌樣本的免疫組化顯示了在蛋白質(zhì)水平的腫瘤組織中METTL3表達(dá)顯著降低（圖1h）。

METTL14 +/-細(xì)胞表現(xiàn)出m6A mRNA甲基化減少，并且m6A甲基化的減少與腫瘤樣品中觀察到的相似（圖2a）。與METTL14在子宮內(nèi)膜癌中喪失功能的作用一致，METTL14的雜合敲除增加了細(xì)胞增殖，集落形成，細(xì)胞遷移和侵襲（圖2b-e）。通過(guò)野生型METTL14但不是突變型METTL14的穩(wěn)定表達(dá)，可以部分挽救因m6A甲基化減少引起的細(xì)胞生理學(xué)變化（圖2a-e）。與突變型METTL14的表達(dá)相似，METTL3的敲低相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞降低了m6A mRNA甲基化的總體水平并促進(jìn)了細(xì)胞增殖，集落形成，遷移和侵襲（圖2f-j）。相對(duì)于野生型HEC-1-A細(xì)胞，METTL14 +/-敲除細(xì)胞顯示出更大的腫瘤和轉(zhuǎn)移數(shù)量的增加（圖2k）。當(dāng)比較用野生型和突變型METTL14拯救METTL14 +/-細(xì)胞時(shí)（圖2l）和將METTL3敲低的HEC-1-A細(xì)胞與對(duì)照（圖2m）進(jìn)行比較時(shí)，可以觀察到類(lèi)似的趨勢(shì)。總之，這些結(jié)果表明，在患者子宮內(nèi)膜腫瘤樣本中觀察到的m6A mRNA甲基化減少，無(wú)論是由METTL14（R298P）突變還是由METTL3表達(dá)降低誘導(dǎo)，都可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的致瘤性，并可能在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用。

圖2：降低的m6A甲基化增加了細(xì)胞增殖遷移等

在超過(guò)一半的患者樣本中檢測(cè)到的m6A峰中，作者發(fā)現(xiàn)與鄰近的正常對(duì)照組織相比，腫瘤中m6A mRNA甲基化全局減少（圖3a）。 在至少兩個(gè)樣品中顯示減少的m6A甲基化轉(zhuǎn)錄物富集在細(xì)胞遷移，增殖，生長(zhǎng)，粘附和細(xì)胞死亡相關(guān)的基因通路（GO）上（圖3b）。 GO分析確定AKT /蛋白激酶B信號(hào)通路在患者樣本（P = 1.51×10-8）和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系（P = 1.02×10-8）中通過(guò)減少m6A甲基化而發(fā)生顯著改變（圖3b）。 與腫瘤相鄰組織相比，參與AKT途徑的許多基因顯示其腫瘤中m6A甲基化減少（圖3c，d）。

圖3：m6A甲基化降低的腫瘤測(cè)序結(jié)果

作者接下來(lái)通過(guò)研究AKT的磷酸化狀態(tài)來(lái)確定子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中m6A甲基化減少是否會(huì)影響AKT信號(hào)傳導(dǎo)。 與相關(guān)對(duì)照細(xì)胞系（分別為野生型HEC-1-A細(xì)胞，野生型METTL14和shControl）相比， METTL14功能喪失的HEC-1-A細(xì)胞系（METTL14 +/-，突變體METTL14和shMETTL14）顯示AKT Ser-473磷酸化增加（圖4a）。 相反，Thr-308的磷酸化和總AKT蛋白表達(dá)保持不變（圖4a）。 為了評(píng)估這些AKT磷酸化的變化是否刺激AKT信號(hào)傳導(dǎo)，作者檢測(cè)了AKT下游蛋白的磷酸化狀態(tài)（圖4b）。

圖4：降低的m6A激活了AKT

編碼PHLPP2的轉(zhuǎn)錄物和mTORC2復(fù)合物的三種組分（PRR5，PRR5L和mTOR）顯示其在患者樣品中m6A甲基化降低（圖4c）。 這些轉(zhuǎn)錄物還在METTL14缺失和METTL3敲低HEC-1-A細(xì)胞系中顯示出m6A甲基化降低（圖4d）。 為了研究蛋白質(zhì)表達(dá)的這些變化是否發(fā)生在腫瘤組織中，作者在正常子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜腫瘤中進(jìn)行組織免疫組化（IHC）染色（圖4e，f）。

HEC-1-A細(xì)胞中YTHDF1的短干擾RNA（siRNA）敲低使PHLPP2的表達(dá)降低至與敲低METTL3相似的程度（圖5a）。PHLPP2表達(dá)的這些變化不是由于PHLPP2轉(zhuǎn)錄物豐度的變化，而是由于PHLPP2轉(zhuǎn)錄物與活躍的轉(zhuǎn)錄核糖體的結(jié)合（圖5b，c）。siRNA敲低 YTHDF2增加了PRR5，PRR5L和mTOR轉(zhuǎn)錄物的豐度，并且這些轉(zhuǎn)錄物在YTHDF2敲低后顯示降低的RNA衰減速率（圖5b，g-i）。

圖5：Akt 通路受到m6A閱讀蛋白的調(diào)節(jié)

為了證實(shí)作者的結(jié)果不僅僅在HEC-1-A子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系，作者在基質(zhì)細(xì)胞（T-HESC），一種正常的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的m6A介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和AKT信號(hào)傳導(dǎo)的變化（圖6）。

圖6：m6A在T-HESC細(xì)胞系中的情況

PHLPP2的過(guò)表達(dá)（圖7a）和RICTOR的敲低（圖7b）都降低了METTL3敲低，METTL14突變體和METTL14 +/- HEC-1-A細(xì)胞中p-AKT（S473）的水平。 METTL3敲低細(xì)胞中的PHLPP2過(guò)表達(dá)或RICTOR敲低降低了細(xì)胞增殖速率，而這些處理對(duì)對(duì)照細(xì)胞的影響小得多（圖7c）。

圖7：m6A通過(guò)Akt通路來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞增殖

該研究層次結(jié)構(gòu)清晰，適合剛?cè)腴T(mén)表觀遺傳或者m6A甲基化研究閱讀。該文獻(xiàn)很好地展示了如何從疾病中發(fā)現(xiàn)m6A相關(guān)復(fù)合物的異常變化（figure1），從而進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其和腫瘤的增殖等表型存在關(guān)聯(lián)（figure2）。之后，再通過(guò)測(cè)序和通路分析發(fā)現(xiàn)m6A相關(guān)復(fù)合物的異常變化和細(xì)胞增殖、AKT信號(hào)通路激活存在關(guān)聯(lián)（figure3）。隨后通過(guò)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了m6A相關(guān)復(fù)合物和AKT激活存在上下游的因果聯(lián)系（figure4）。而在m6A相關(guān)復(fù)合物和AKT激活之間，作者通過(guò)PHLPP2和mTOR建立聯(lián)系，即PHLPP2和mTOR的m6A甲基化導(dǎo)致了AKT激活。最后，作者再進(jìn)行簡(jiǎn)單的驗(yàn)證，m6A甲基化通過(guò)PHLPP2和mTOR來(lái)促進(jìn)AKT激活和細(xì)胞增殖（figure7）。

全篇邏輯嚴(yán)謹(jǐn)，在m6A相關(guān)復(fù)合物（機(jī)制），m6A甲基化（機(jī)制），PHLPP2和mTOR（機(jī)制），AKT激活（機(jī)制），細(xì)胞增殖（表型）和腫瘤發(fā)生（疾病）這一條線(xiàn)上，逐一進(jìn)行驗(yàn)證。在in vitro層面，作者只做了m6A相關(guān)復(fù)合物和腫瘤發(fā)生的關(guān)系研究，當(dāng)中缺少進(jìn)一步驗(yàn)證AKT激活的情況。