這一段時(shí)間我們介紹了最近幾年來(lái)的科研熱點(diǎn)，有ncRNA和外泌體等，今天就趁著這個(gè)熱度，我們來(lái)介紹一下“甲基化”熱點(diǎn)，了解關(guān)于“甲基化”熱點(diǎn)的一般流程如何快速發(fā)文。

首先我們來(lái)了解一下甲基化，甲基化包括兩種：DNA甲基化或蛋白質(zhì)甲基化。

DNA甲基化：脊椎動(dòng)物的DNA甲基化一般發(fā)生在CpG位點(diǎn)（即DNA序列中胞嘧啶后緊連鳥(niǎo)嘌呤的位點(diǎn)），經(jīng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶。

蛋白質(zhì)甲基化：蛋白質(zhì)甲基化是在組蛋白中研究最多的一類，一般指精氨酸或賴氨酸在蛋白質(zhì)序列中的甲基化，在組蛋白轉(zhuǎn)移酶的催化下，S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移到組蛋白。某些組蛋白殘基通過(guò)甲基化可以抑制或激活基因表達(dá)，從而形成為表觀遺傳。

現(xiàn)在我們來(lái)看下今天的文章：

這篇文章發(fā)表在影響因子為4.122的《Scientific Reports》期刊上。

文章的研究思路：

作者首先提出問(wèn)題：相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)飲食（STD），在經(jīng)常食用富含膽固醇的西方式高脂飲食（HFD）的12周小鼠肝臟中，lncRNA基因是否可以調(diào)節(jié)其兩側(cè)或重疊蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄和甲基化。

然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：作者設(shè)置兩組動(dòng)物模型，一組喂食標(biāo)準(zhǔn)飲食（STD），一組喂食西方式高脂飲食（HFD），持續(xù)12周之后處死小鼠，獲取組織，提取RNA，進(jìn)行高通量測(cè)序，RNA測(cè)序之后尋找推測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。

最后進(jìn)行生信分析，進(jìn)行差異甲基化分析。

我們來(lái)看方法和結(jié)果：

1、小鼠RNA測(cè)序結(jié)果表明，13365個(gè)基因中包含11993個(gè)蛋白編碼基因，765個(gè)假基因和607個(gè)ncRNA基因。

2、使用R語(yǔ)言包進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，得到425個(gè)差異表達(dá)基因，包括395個(gè)蛋白編碼基因、6個(gè)lncRNA基因、7個(gè)反義RNA基因、2個(gè)轉(zhuǎn)錄基因、13個(gè)假基因和2個(gè)snRNA基因。

聚類分析清楚的表明了HFD和STD肝臟的基因表達(dá)特征，采用nCounter技術(shù)驗(yàn)證大多蛋白編碼基因的fold-change值。

3、為了排除基因表達(dá)變化與肝細(xì)胞類型組成的差異相關(guān)，作者使用數(shù)字排序算法(DSA)和CellMix1.6中的meanProfile方法來(lái)估計(jì)細(xì)胞類型頻率，結(jié)果表明在HFD和STD肝臟中有相似的細(xì)胞類型組成。 并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行通路分析，發(fā)現(xiàn)主要集中在類固醇生物合成、膽固醇代謝、脂肪酸代謝、脂質(zhì)定位和晝夜節(jié)律上。

4、lncRNA基因的表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了十種豐度最高的lncRNA：Yam1、Malat1、Gm26870、RP23-181K4.2、B430119L08Rik、1700020I14Rik、Neat1、Kcnq1ot1、Gm15564和Brip1os。

對(duì)lncRNA臨近或重疊的蛋白質(zhì)編碼基因做共表達(dá)分析，識(shí)別到299個(gè)lncRNA/蛋白質(zhì)編碼基因?qū)?。發(fā)現(xiàn)lncRNA與VISTA中注釋的小鼠增強(qiáng)子沒(méi)有重疊，表明這些lncRNA基因可能不是增強(qiáng)子衍生的RNAs。

5、在飲食響應(yīng)的lncRNA基因中，EdgeR鑒定了14個(gè)不同表達(dá)的lncRNA基因，NBART技術(shù)檢測(cè)11種LncRNA基因的差異表達(dá)。

只有4對(duì)共表達(dá)的lncRNA/蛋白編碼基因?qū)︼嬍秤蟹磻?yīng)，因此，共表達(dá)的飲食反應(yīng)蛋白編碼基因中沒(méi)有一個(gè)在過(guò)表達(dá)的生物過(guò)程中起作用。

6、通過(guò)5MeTIP-seq方法對(duì)DNA甲基化進(jìn)行全基因組評(píng)估，結(jié)果表明共檢測(cè)到了154664個(gè)甲基化區(qū)域，36383個(gè)共有的甲基化區(qū)域，這些區(qū)域位于蛋白質(zhì)編碼基因、非編碼基因和假基因中，其中有1690個(gè)甲基化區(qū)域映射到注釋的CpG島上。

7、用5MeTIP-seq方法分析飲食誘導(dǎo)的DNA甲基化，發(fā)現(xiàn)STD和HFD肝臟的DNA甲基化僅存在非常輕微的差異，并且應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法發(fā)現(xiàn)這些差異并不顯著。

最后為了評(píng)估5meDIP-seq對(duì)差異性DNA甲基化的驗(yàn)證，用亞硫酸氫鹽測(cè)序了10個(gè)甲基化區(qū)域，發(fā)現(xiàn)分別映射到了10個(gè)基因上，結(jié)果表明在10個(gè)檢測(cè)甲基化區(qū)域中的9個(gè)不存在差異。

文章的大致思路就是這樣，作者首先對(duì)標(biāo)準(zhǔn)飲食（STD）組和高脂飲食（HFD）組的小鼠肝臟進(jìn)行RNA-seq和甲基化差異分析，篩選了差異表達(dá)的lncRNA和蛋白質(zhì)編碼基因，之后進(jìn)行通路富集分析，然后篩選lncRNA/蛋白質(zhì)編碼基因?qū)?，最后分析重要基因，?duì)其進(jìn)行差異甲基化分析。

這篇文章和實(shí)驗(yàn)都較為簡(jiǎn)單，且沒(méi)有什么套路，流程也是一般流程，但是分析的內(nèi)容較多，且又是關(guān)于當(dāng)前熱點(diǎn)“甲基化”，所以還是發(fā)到了4分的期刊，除此之外，文中涉及到的軟件和算法也值得我們學(xué)習(xí)。