1. Western blot結(jié)果中的背景為什么較高?

可能的原因及建議

1. 膜封閉不夠——延長(zhǎng)封閉的時(shí)間；選擇更加適合的封閉液。
2. 一抗稀釋度不適宜——對(duì)抗體進(jìn)行滴度測(cè)試，選擇最適宜的抗體稀釋度。
3. 一抗孵育的溫度偏高——建議4℃結(jié)合過(guò)夜。
4. 膜在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中干過(guò)——實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要注意保持膜的濕潤(rùn)。
5. 檢測(cè)時(shí)曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)——減少曝光時(shí)間。

2. Western blot結(jié)果中雜帶較多

可能的原因及建議

1. 目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)（磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、乙酰化位點(diǎn)等），本身可以呈現(xiàn)多條帶。
   查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過(guò)去修飾確定蛋白實(shí)際大小。
2. 目的蛋白有其它剪切本——查閱文獻(xiàn)或生物信息學(xué)分析可能性。
3. 樣本處理過(guò)程中目的蛋白發(fā)生降解——加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時(shí)在冰上操作。
4. 上樣量過(guò)高，太敏感——適當(dāng)減少上樣量。
5. 一抗特異性不高——重新選擇或制備高特異性的抗體。
6. 一抗不純——純化抗體
7. 一抗或者二抗?jié)舛绕摺档涂贵w濃度。

3. Western blot結(jié)果中無(wú)信號(hào)或顯示信號(hào)弱

可能的原因及建議

1. 檢測(cè)樣本不表達(dá)目的蛋白——選擇表達(dá)量高的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，用于確定檢測(cè)樣本是否為陰性。
2. 檢測(cè)樣本低表達(dá)目的蛋白——提高上樣量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑。
3. 轉(zhuǎn)移不完全或過(guò)轉(zhuǎn)移——可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠（考馬斯亮藍(lán)）后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過(guò)頭；適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時(shí)間和電流。
4. 抗體不能識(shí)別測(cè)試種屬的相關(guān)蛋白——購(gòu)買(mǎi)抗體前應(yīng)當(dāng)認(rèn)真閱讀抗體說(shuō)明書(shū)，確定其是否能夠交叉識(shí)別測(cè)試種屬的對(duì)應(yīng)蛋白。
5. 一抗孵育時(shí)間不足——建議4℃結(jié)合過(guò)夜。
6. 二抗與一抗不匹配——選擇針對(duì)一抗來(lái)源的種屬的抗體。
7. 洗膜過(guò)度——洗膜時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，加入的去垢劑不宜過(guò)強(qiáng)或過(guò)多，建議使用0.1%的弱去垢劑Tween-20。

4. 其它現(xiàn)象：

1. 膜上多處出現(xiàn)黑點(diǎn)或黑斑——抗體與封閉試劑發(fā)生非特異性的結(jié)合。
2. 反白（條帶顯白色）——目的蛋白含量太高或者一抗?jié)舛绕摺?/li>
3. 蛋白分子量偏低或偏高——膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠；小分子蛋白要用高濃度膠。

5. TBS與PBS的區(qū)別

PBS的緩沖能力強(qiáng)于TBS（因?yàn)榛旌暇彌_液在一定的離子強(qiáng)度下常常具有更寬的緩沖范圍），TBS在PH7.0以下緩沖能力較弱（不過(guò)PBS易污染）。但我們常常要根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x用合適的緩沖液，如在蛋白純化中進(jìn)行陰離子交換層析，陽(yáng)離子緩沖液首選TBS；陽(yáng)離子交換層析時(shí)，陰離子緩沖液則首選PBS。
Western blot中使用TBS和PBS均可，只是要根據(jù)需要選擇合適的濃度。

6. Western是否可以同時(shí)加兩種或者多種一抗

通常情況下只加一種一抗。做Western在同一張膜上檢測(cè)目的蛋白和內(nèi)對(duì)照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片；漂洗以后，再上內(nèi)對(duì)照的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片。

7. PVDF與NC膜的區(qū)別

PVDF膜價(jià)格較貴，可重復(fù)使用，結(jié)合能力較強(qiáng)。

NC膜價(jià)格比較便宜，應(yīng)用較廣，結(jié)合牢固性較PVDF膜差，韌性也不如PVDF，不能重復(fù)使用，但蛋白吸附容量高，親水性較好。

8. Western一抗的選用

理論上單抗比多抗的特異性要好，但單抗種類(lèi)較少一般價(jià)格偏高，所以一般來(lái)說(shuō)多抗足夠了。

9. Western抗體和ELISA抗體的區(qū)別

一般來(lái)說(shuō)用于western的抗體主要識(shí)別氨基酸序列特異性；而可用于ELISA的抗體則要看抗原種類(lèi)，有些是識(shí)別氨基酸序列特異性，有些是識(shí)別構(gòu)像特異性。所以一般根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)來(lái)確定。

做免疫印跡時(shí)選擇抗體主要應(yīng)考慮兩個(gè)問(wèn)題，一是所選抗體是否能識(shí)別凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至膜上的變性蛋白，另一個(gè)是所選抗體是否會(huì)引起交叉反應(yīng)條帶。

10. “短路”現(xiàn)象的產(chǎn)生和處理

如果紙、膜比凝膠大就比較容易形成短路了，上下兩層慮紙也不能因過(guò)大而相互接觸，這樣同樣會(huì)短路，電流不會(huì)通過(guò)膠和慮紙。轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移過(guò)程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的， 最后結(jié)束時(shí)一般是開(kāi)始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和濾紙選的對(duì)就不會(huì)短路。

11. Western Blot的染色

1. 陰離子染料是較常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測(cè)極限可達(dá)到1.5μg，考馬斯亮藍(lán)雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測(cè)后容易從蛋白質(zhì)中除去，以便進(jìn)行隨后的氨基酸分析。缺點(diǎn)是：溶劑系統(tǒng)的甲醇會(huì)引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用語(yǔ)正電賀的膜。靈敏度低。
2. 膠體金，靈敏度高，檢測(cè)范圍可到pg級(jí)，但染色比穩(wěn)定。
3. 生物素化靈敏度位于1、2之間，可用于任何一種膜。

12. 大分子量蛋白轉(zhuǎn)移效率低的解決方法

可以在轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度），因?yàn)榧状寄茉黾拥鞍踪|(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，同時(shí)可以延長(zhǎng)高分子量蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；選用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯(lián)。太大時(shí)還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉(zhuǎn)移電壓／電流；增加轉(zhuǎn)移時(shí)間。

13. DAB顯色、堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色原理

DAB顯色在辣根過(guò)氧化酶的作用下能形成一種灰褐色的產(chǎn)物，該產(chǎn)物難溶于醇和其他有機(jī)溶劑，DAB的氧化還能引起聚合作用，導(dǎo)致與四氧化鋨反應(yīng)而增加其染色強(qiáng)度和電子密度。堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色中，酶將奈酚磷酸（底物）水解成酚類(lèi)和磷酸。酚和無(wú)色的重氮鹽（顯色原）結(jié)合而產(chǎn)生有色的、不溶性偶氮染料。

14. 酶顯色與熒光顯色的優(yōu)缺點(diǎn)

免疫酶技術(shù)就是用酶標(biāo)記已知抗體（或抗原），然后與組織標(biāo)本在一定條件下反應(yīng)并結(jié)合，結(jié)合形成的復(fù)合物中所含有的酶分子遇到底物時(shí)，會(huì)催化底物水解、氧化或還原，從而發(fā)生顯色反應(yīng)。免疫酶組化技術(shù)分為酶標(biāo)記法與非標(biāo)記抗體技術(shù)，前者是將酶通過(guò)交聯(lián)劑結(jié)合在抗體分子上，形成酶標(biāo)記抗體。后者是將酶作為抗原與相應(yīng)的特異性抗體連接進(jìn)行的免疫反應(yīng)，稱(chēng)為非標(biāo)記抗體酶技術(shù)。

免疫熒光技術(shù)中的熒光抗體染色標(biāo)本不能長(zhǎng)期保存，對(duì)組織細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)分辨不清，但免疫酶技術(shù)則能克服上述不足，標(biāo)記免疫酶技術(shù)的敏感性更優(yōu)于免疫熒光法。酶顯色產(chǎn)物具有較高的電子密度，經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理還可以進(jìn)行免疫電鏡觀察。