一：下載安裝該軟件

下載htseq這個python模塊安裝解壓包，依賴于很多python的其它安裝包及庫，模塊，我最討厭python了，在有些電腦上特別難安裝，而且服務(wù)器還有權(quán)限的問題。

解壓進(jìn)入該目錄，輸入 python setup.py   install  --user  記住，是- - 而不是—

這樣只是把這個軟件安裝到自己的目錄

安裝完畢后，會出現(xiàn)這兩個程序，在自己的python庫里面，可以直接調(diào)用這兩個程序的，我這里它們的路徑是 .local/bin ，很奇怪的一個路徑，我也是用find命令才找到的

我在這里主要講解，在這里調(diào)用這個命令來進(jìn)行操作，直接把它當(dāng)做一個程序來使用，而不是僅僅當(dāng)做是python里面的一個模塊調(diào)用，不需要import HTseq。

二：準(zhǔn)備數(shù)據(jù)

輸入文件

輸入為sam格式的文件，如果是paired-end數(shù)據(jù)必須按照reads名稱排序（sort by name）。先用samtools先對bam文件（tophat2的輸出結(jié)果為bam）排序，再轉(zhuǎn)換為sam。

  命令：samtools sort -n file.bam #sort bam by name

        samtools view -h bamfile.bam>samfile.sam

其實可以是任意的sam文件，在這里我主要演示我自己跑tophat出來的bam文件轉(zhuǎn)為的sam文件，就是三個RNA數(shù)據(jù)的結(jié)果

    這樣得到的三個sam文件特別大，bam文件是sam的二進(jìn)制文件才三五個G，到了sam格式就是十幾二十個G了，其實完全沒必要自己把它轉(zhuǎn)為sam文件，因為htseq有個參數(shù)-f可以控制輸入格式是bam文件。

三：運行命令

官方的Usage：htseq-count [options] <sam_file> <gff_file>

HTSeq的作者Simon Anders建議使用ENSEMBL的gtf文件。  但是如果用了ensembl的，那么之前tophat就應(yīng)該用ensembl的gtf作為參考來比對

也可以使用python -m HTSeq.scripts.count instead of htseq-count

我的命令是：

 /home/jmzeng/.local/bin/htseq-count case1.sam   /home/jmzeng/ref-database/hg19.gtf

但是我還是喜歡批處理來運行，一次性解決所有的bam文件計數(shù)問題

出來得到的日志是這樣的

約等待幾個小時就OK啦

四：輸出文件解讀

共兩萬多個基因，每個基因一行，基因名加上count數(shù)

可以head看一下里面的內(nèi)容如下

tips; 1，你可以用--idattr transcript_id來指定程序計算轉(zhuǎn)錄本而不是基因，但是這樣會導(dǎo)致共有轉(zhuǎn)錄本重合地方太多

參考：

安裝http://pgfe./ou/archives/2549

操作htseq的方法http://www-huber./users/anders/HTSeq/doc/tour.html

http://chenxindayangzhou.blog.163.com/blog/static/2809209220137234916786/

另外一個操作方法http://www-huber./users/anders/HTSeq/doc/count.html