1．目的

建立菌種確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，以減少菌種污染和生長特性的改變，保證實驗結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

2．依據(jù) 《中國藥典》

3．范圍 本規(guī)程適用于質(zhì)量控制實驗室所用標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株。

4．責(zé)任 質(zhì)量部，質(zhì)量控制實驗室

5．內(nèi)容

5.1 試驗菌株

大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]

白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98001]

黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]

5.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株

5.1.1.1標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)來自認(rèn)可的國內(nèi)或國外菌種收藏機(jī)構(gòu)。

5.1.1.2標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)過復(fù)活并在適宜的培養(yǎng)基中生長后，即為標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株。

5.1.1.3標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株應(yīng)進(jìn)行純度和特性確認(rèn)。

5.1.2工作菌株

5.1.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株可用于制備每月或每周一次轉(zhuǎn)種的工作菌株

5.1.2.2工作菌株的傳代次數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制，不得超過5 代（從菌種收藏機(jī)構(gòu)獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株為第0代），以防止過度的傳代增加表型變化的風(fēng)險。因此必要時，應(yīng)對工作菌株的純度和特性進(jìn)行確認(rèn)。

5.2 菌種確認(rèn)試驗的主要內(nèi)容

5.2.1 菌種的純度確認(rèn)

5.2.1.1純度檢測：是指通過適當(dāng)?shù)姆椒z測菌種是否為純培養(yǎng)物。

5.2.1.2試驗內(nèi)容

①菌落形態(tài)：在特定的培養(yǎng)基上，將待檢測培養(yǎng)物稀釋涂布或平板劃線，適宜培養(yǎng)后，同一平板上的單菌落的大小、形狀、顏色、質(zhì)地、光澤等是否相似；對于兩種或以上形態(tài)的出發(fā)菌株，應(yīng)再分別挑取單菌落劃線或稀釋涂布培養(yǎng)，檢測是否重復(fù)出現(xiàn)相同特征。

②鏡檢特征：對數(shù)生長期的培養(yǎng)物革蘭氏染色反應(yīng)應(yīng)呈現(xiàn)一致性；細(xì)胞形狀、大小、莢膜、芽孢等特征應(yīng)相似。

5.2.2 菌種的特性確認(rèn)

5.2.2.1生化試驗：各種微生物具有各自的獨特的酶系統(tǒng)，因而在代謝過程中所參與的物質(zhì)分解和合成代謝的產(chǎn)物也不同，這些代謝產(chǎn)物又具有不同的生化特征。根據(jù)此特征，利用生物化學(xué)方法來鑒定不同的微生物的試驗即為微生物的生化試驗。

5.3 菌種的確定方法

用無菌接種環(huán)粘取培養(yǎng)物，在相應(yīng)的培養(yǎng)基平板上劃線分離單個菌落，并在適宜條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)后觀察是否具有典型的菌落形態(tài)，然后挑取單一純菌落，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，觀察其染色特性及菌形。再做生化試驗或使用菌種鑒定系統(tǒng)進(jìn)一步鑒定菌種。

5.3.1 大腸埃希菌的確認(rèn)

5.3.1.1 菌落形態(tài)

5.3.1.1.1 取大腸埃希菌新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24h 后，形成菌膜，管底有粘液狀沉淀，培養(yǎng)物有糞臭味。

5.3.1.1.2 取上述培養(yǎng)物接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂(EMB)瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板上，35℃培養(yǎng)18～24h 后，觀察結(jié)果。

①曙紅亞甲藍(lán)瓊脂(EMB)

瓊脂平板上菌落形態(tài)呈紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色,菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑、濕潤，常有金屬光澤。

②麥康凱瓊脂平板上菌落形態(tài)呈鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤。

5.3.1.2 革蘭染色、鏡檢

5.3.1.2.1 革蘭染色

①以接種環(huán)沾取無菌水于潔凈載玻片上，取菌落形態(tài)（①、②）的培養(yǎng)物少許，制成均勻涂片，自然或微溫，再通過火焰2～3 次干燥使固定。

②滴加結(jié)晶紫染液，染色1min，水洗。

③滴加碘液，媒染1min，水洗，以濾紙吸干余水。

④滴加95﹪乙醇，脫色20～30s，至流出液無色，水洗。

⑤滴加沙黃染液，復(fù)染1min，待干后，鏡檢。

5.3.1.2.2 染色結(jié)果應(yīng)是：革蘭陽性菌呈藍(lán)紫色：革蘭陰性菌呈紅色。

5.3.1.2.3 鏡檢結(jié)果應(yīng)是：兩端鈍圓的短小直桿菌，單個或成對，革蘭陰性，無芽孢，多有鞭毛，以周身鞭毛運動或不運動，許多菌株有莢膜和微莢膜。

5.3.1.3 生化試驗

5.3.1.3.1靛基質(zhì)試驗（I）：取菌落形態(tài)（①、②）的培養(yǎng)物接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24-48h，沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，輕輕搖動試管，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。

5.3.1.3.2 甲基紅試驗（M）：取菌落形態(tài)（①、②）的培養(yǎng)物接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48+2h，于培養(yǎng)液中加入甲基紅指示液2～3 滴（約1ml 培養(yǎng)液加指示液1 滴），輕微搖動，立即觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈黃色為陰性。

5.3.1.3.3 乙酰甲基甲醇生成試驗（V-P）：取菌落形態(tài)（①、②）的培養(yǎng)物接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48+2h，于2ml 培養(yǎng)液中加入α-萘酚乙醇試液1ml，混勻，再加40%氫氧化鉀試液0.4ml，充分振搖，在4h（通常在30min）內(nèi)出現(xiàn)紅色應(yīng)判為陽性，無紅色反應(yīng)為陰性。

5.3.1.3.4 枸櫞酸鹽利用試驗（C）：取菌落形態(tài)（①、②）的培養(yǎng)物接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)2-4 天，培養(yǎng)基斜面有菌苔生成，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色時為陽性，培養(yǎng)基顏色無改變、無菌苔生長為陰性。

5.3.1.3.5 乳糖發(fā)酵試驗：取菌落形態(tài)（①、②）的培養(yǎng)物接種于乳糖發(fā)酵管，培養(yǎng)24-48h，觀察產(chǎn)酸（指示劑為酸性品紅者為紅色：指示劑為溴麝香草酚藍(lán)者為黃色），產(chǎn)氣（小倒管內(nèi)有氣泡，氣泡無論大小都是產(chǎn)氣）。

5.3.2 金黃色葡萄球菌的確認(rèn)

5.3.2.1 菌落形態(tài)

5.3.2.1.1 取金黃色葡萄球菌新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24h 后，呈均勻渾濁生長，繁殖較多時易產(chǎn)生沉淀，沉淀易被搖散。

5.3.2.1.2 取上述培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂平板和卵黃氯化鈉瓊脂平板上培養(yǎng)24～27h 觀察結(jié)果。

①甘露醇氯化鈉瓊脂平板上菌落形態(tài)金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃色環(huán),菌落直徑0.7-1mm。

②卵黃氯化鈉瓊脂平板上菌落形態(tài)金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有卵磷脂分解的乳濁圈，菌落直徑1-2mm。

5.3.2.2 革蘭染色、鏡檢

5.3.2.2.1 革蘭染色（見大腸埃希菌檢查法5.3.1.2）

5.3.2.2.2 鏡檢結(jié)果：為革蘭陽性球菌，菌體呈球形或略呈橢圓形，菌體較小，菌體大小不一。無芽孢，一般不產(chǎn)生莢膜。排列呈不規(guī)則的葡萄狀，亦可呈單個、成雙或短鏈狀排列。

5.3.2.3 生化試驗

5.3.2.3.1 血漿凝固酶試驗

試管法：取無菌試管（10mm×10mm）2 支，各加入血漿和0.9%無菌氯化鈉溶液（1：1）0.5ml，1 支加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液0.5ml 作為陽性對照：另一支加入無菌營養(yǎng)肉湯0.5ml 作為陰性對照。兩管同時置37℃水浴或恒溫培養(yǎng)箱，3h 后開始檢查，以后每隔適當(dāng)時間觀察一次，直至24h。檢查時，輕輕將試管傾斜（動作勿大），仔細(xì)觀察。

①陽性對照管：血漿和無菌水混合液加金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，在3h 后開始觀察直至24h。結(jié)果：血漿凝固。

②陰性對照管：血漿和無菌水混合液加稀釋液，在3h 后開始觀察直至24h。結(jié)果：血漿流動自如。

5.3.3 枯草芽孢桿菌的確認(rèn)

5.3.3.1 菌落形態(tài)

5.3.3.1.1 取枯草芽孢桿菌新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24h 后，呈渾濁生長。

5.3.3.1.2 取上述培養(yǎng)物劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，培養(yǎng)24～27h觀察結(jié)果：菌落為灰色、干燥、皺縮、無典型卷發(fā)狀。

5.3.3.2 革蘭染色、鏡檢

5.3.3.2.1 革蘭染色（見大腸埃希菌檢查法

5.3.3.2.2鏡檢結(jié)果：革蘭陽性芽孢桿菌芽孢為橢圓到柱狀，位於菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。

5.3.4 白色念珠菌的確認(rèn)

5.3.4.1 菌落形態(tài)

5.3.4.1.1 取白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)35℃培養(yǎng)24～48h 后，呈渾濁生長。

5.3.4.1.2 取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，經(jīng)30～35℃培養(yǎng)24～48h（必要時延長至72 小時）觀察結(jié)果：呈乳白色偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有皺摺。

5.3.4.1.3 取上述（5.3.4.1.2）培養(yǎng)物接種至白色念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，經(jīng)30～35℃培養(yǎng)24～48h（必要時延長至72 小時）觀察結(jié)果：平板上為綠色或翠綠色的菌落生長。

5.3.4.2 革蘭染色、鏡檢及芽管試驗

取上述（5.3.4.1.3）培養(yǎng)物接種至1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48h。取培養(yǎng)物進(jìn)行染色，鏡檢及芽管試驗。

5.3.4.2.1 革蘭染色（見大腸埃希菌檢查法5.3.1.2）

5.3.4.2.2 芽管試驗：挑取1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清的載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤的平皿內(nèi)，置35～37℃培養(yǎng)1～3h，置顯微鏡下觀察，可見到由孢子長出短小芽管。

5.3.4.2.3

鏡檢結(jié)果：革蘭陽性芽孢桿菌芽孢為厚膜孢子、菌絲、芽管。

5.3.5

黑曲霉菌的確認(rèn)

5.3.5.1

鏡檢：可見孢子，菌絲。