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血培養(yǎng)瓶（雙相瓶） 腦膜炎奈瑟菌 ATCC 13090：生長良好，均勻渾濁。 銅綠假單胞菌ATCC 27853：普通環(huán)境24 h孵育，生長良好，均勻渾濁，有菌膜。 金黃色葡萄球菌 ATCC 25923：普通環(huán)境24 h孵育，生長良好，均勻渾濁，溶血。 化膿性鏈球菌 ATCC 19615： 24 h肉眼可見固相菌落生長現(xiàn)象，白色顆粒狀沉淀，溶血。 流感嗜血桿菌 ATCC 49247：24 h肉眼可見固相菌落生長現(xiàn)象，均勻渾濁。 白色念珠菌 ATCC 10231：48 h肉眼可見固相菌落生長現(xiàn)象，團塊狀白色沉淀，輕微渾濁。 麥康凱培養(yǎng)基 質(zhì)控菌株：大腸、奇異、鼠傷寒、糞腸球菌、銅綠 首次評價內(nèi)容：外觀、菌落形態(tài)顏色、抑制能力、干擾回收試驗、臨床標本試用 平時評價內(nèi)容： 抑制能力：糞腸球菌ATCC 29212，接種量1000cfu：24h不生長 菌落形態(tài)： 接種菌量：100~300cfu 大腸埃希菌 ATCC 25922：紫紅色大菌落 鼠傷寒沙門菌 ATCC 14028：無色中等菌落 奇異變形菌 ATCC 12453：淡橙色大菌落 銅綠假單胞菌ATCC 27853：無色到綠色中等菌落 頻率：該培養(yǎng)基比較穩(wěn)定，每批檢測一次即可 SS培養(yǎng)基 質(zhì)控菌株：鼠傷寒沙門菌、福氏志賀菌、大腸、糞腸球菌 首次評價內(nèi)容：外觀、菌落形態(tài)顏色、抑制能力、干擾回收試驗（重點）、臨床標本試用（重點） 平時評價內(nèi)容： 抑制能力： 糞腸球菌ATCC 29212，接種量1K-2Kcfu：24h不生長； 大腸埃希菌 ATCC 25922，接種量1K-2Kcfu：24h部分抑制， 菌落顏色紫紅色 菌落形態(tài)： 接種菌量：100~1000cfu 鼠傷寒沙門菌 ATCC 14028：無色中心黑色大菌落 福氏志賀菌ATCC 12022：無色透明中等菌落 頻率：該培養(yǎng)基比較穩(wěn)定，每批檢測一次即可 TM培養(yǎng)基 質(zhì)控菌株：淋病奈瑟菌、金葡、大腸、白念、普通變形桿菌 首次評價內(nèi)容：菌落大小、抑制能力、干擾回收試驗（重點）、臨床標本試用（重點） 平時評價內(nèi)容： 抑制能力（接種量1K-2Kcfu ）： 金黃色葡萄球菌 ATCC 25923：不生長。 大腸埃希菌 ATCC25922：不生長。 白色念珠菌 ATCC 10231：不生長。 普通變形桿菌 ATCC 12453：不生長。 菌落大?。ń臃N量100-300cfu）：淋病奈瑟菌 ATCC 49226：24 h菌落直徑大于1.0 mm 頻率：一周內(nèi)用完的培養(yǎng)基，每批一次；超過一周后，每周監(jiān)測，合格的使用，否則棄去 試劑的正確保存與穩(wěn)定性考察 列出不穩(wěn)定試劑清單，制訂相應(yīng)的保存措施與質(zhì)量監(jiān)控措施 對不穩(wěn)定試劑應(yīng)進行穩(wěn)定性考察，以確定本實驗室保存條件下的真實穩(wěn)定期 監(jiān)控措施能及時發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品標注有限期內(nèi)的失效情況，以便及時清理失效試劑 微生物室容易失效的試劑 與穩(wěn)定期考察 氧化酶試劑（每天） 觸酶試劑（每周） V因子紙片、V+X因子紙片（每月） API與ATB中添加劑ZYM試劑（每周） V2C卡片中芳氨酶試劑（每月） 血平板（每周） 巧克力平板（每周） TM培養(yǎng)基（每周） Lancefield酶提取液（每周） 2~8℃避光保存，每個實驗室應(yīng)根據(jù)自身情況制訂自己的穩(wěn)定期 小結(jié)與練習 細菌系統(tǒng)鑒定的定義？ 細菌分類學的經(jīng)典書籍？ 有哪些系統(tǒng)分類法？ 樹狀拓撲學有哪些表現(xiàn)形式？ 細菌鑒定方法學大致分為哪幾類？比較重要的應(yīng)用成果是什么？ 表型鑒定中法應(yīng)用最廣的是哪種方法？ 萬古霉素耐受屬于那一階段的鑒定內(nèi)容？ 枸櫞酸鹽屬于哪一類鑒定試驗？ 芳氨酶試驗屬于哪一類鑒定試驗？ 一個鑒定結(jié)果的id%為76%，T值為0.15，請問該結(jié)果準確嗎？ 一株菌在血瓊脂上微弱生長，巧克力培養(yǎng)基上生長良好，請問接下來我們需要進行哪些試驗才能將之鑒定至種？該菌在同一病區(qū)同一時間段內(nèi)大量被分離到，請問我們還需要做什么試驗才能確認是爆發(fā)流行？ SS培養(yǎng)基上黑色中心，但菌落是粉紅色的，該菌最有可能是哪些細菌？采用什么方法進行確認？ 血培養(yǎng)報陽，涂片G-短小桿菌，動力強陽性，溶血；傳代血平板生長、麥康凱不生長、巧克力不生長。請問該菌可能是什么菌？該菌的鑒定過程中哪一步試驗結(jié)果是錯誤的？ 培養(yǎng)基招標中，我們應(yīng)該如果評價商品化血平板的質(zhì)量才能體現(xiàn)出真正的差別？ 哪種不穩(wěn)定試劑需要每天監(jiān)控？ * * 糞便培養(yǎng)菌落觀察 沙門菌 與志賀菌 ▲沙門菌 : SS中心黑色之乳糖陰性菌落（亞利桑拉群可以為陽性）, MC: 無色菌落 ▲志賀菌：SS、MC均為無色透明菌落 腸致瀉性大腸埃希菌 ▲ O-157大腸埃希菌：SS：為紅色乳糖陽性菌落，SMC為無色透明之山梨醇陰性菌落 ▲其他致病性大腸埃希菌多數(shù)為：SS、SMC均為紅色 ▲其中腸侵襲型大腸埃希菌在SS上可能為無色菌落 弧菌 ▲霍亂弧菌：SS：無色菌落，TCBS：黃色大菌落 ▲其他弧菌：SS、TCBS均為無色或淡綠色菌落 氣單胞菌 所有氣單胞菌轉(zhuǎn)種血瓊脂均呈現(xiàn)β溶血 ▲嗜水氣單胞菌，SS粉紅色菌落，TCBS為黃色，SMC無色之大菌落 ▲其他氣單胞菌：SS無色不透明菌落，TCBS為黃色，MC無色不透明大菌落 ▲鄰單胞菌：SS、TCBS及MC均為無色透明菌落 ▲小腸結(jié)腸耶爾森菌：SS、MC為無色小菌落，SMC為紅色牛眼狀小菌落 特定標本菌落觀察 尿液: ▲ J-K棒狀桿菌：小而濕潤，灰白/無色，半透明，生長慢； ▲支原體：固體培養(yǎng)基上，低倍鏡或解剖顯微鏡下為典型“荷包蛋”樣菌落 各種生殖道標本 ▲淋病奈瑟菌：在TM培養(yǎng)基上為灰/灰白半透明小菌落，非常濕潤；在強化血瓊脂上為灰白凸起，不溶血，有銀色光澤1.0-2.0大小的菌落； ▲陰道加德納爾菌：TM培養(yǎng)基上不生長，強化血瓊脂上無色/灰白，細小，狹窄β溶血的菌落，生長緩慢，多數(shù)需48h才能形成明顯小菌落。 腦脊液 ▲新型隱球菌：BA上為白色，24h為0.5~1.0mm左右大小圓形凸起菌落，不溶血，CHROMagar上生長緩慢，不顯色或略微顯藍色。 ▲腦膜炎奈瑟菌：BA上為無色透明，凸起，1.0-1.5mm左右大小的露滴狀菌落，Choc（營養(yǎng)強化，含奈瑟菌選擇劑）上為灰色有銀色光澤的，半透明，凸起，1.5mm左右大小的濕潤菌落； 血、骨髓標本 ▲紅斑丹毒絲菌：可形成兩種菌落，光滑型細小、圓形突起、有光澤、易乳化；粗糙型菌落大，表面顆粒狀、邊緣如卷發(fā)樣，微а溶血。 ▲乏養(yǎng)菌與顆粒鏈菌：在普通血瓊脂或含血MHA上不生長，在金黃色葡萄球菌菌落周圍具有典型的衛(wèi)星現(xiàn)象。菌落灰白非常濕潤，弱α-溶血或者不溶血。 定向試驗——組合選擇 G-桿菌+麥康凱生長 氧化酶+OF試驗 （- F）→腸桿菌 （+ F）→弧菌 （+/- O/N）→非發(fā)酵菌 微需氧環(huán)境生長 CO2環(huán)境生長 厭氧環(huán)境生長 巧克力培養(yǎng)基CO2環(huán)境生長 （- + + +） →嗜血桿菌→V、X因子需求或衛(wèi)星試驗 （- + + +） →奈瑟菌 （+ - - -） →彎曲菌 （- - + -） →厭氧性G-桿菌 G-桿菌+麥康凱不生長 G+桿菌+麥康凱不生長+拉絲試驗陰性 需氧/厭氧 觸酶 芽孢 動力 厭氧 + + + →梭狀芽孢桿菌 需氧 + - - →棒狀桿菌 需氧 + - + →李斯特菌 需氧 + + + →芽孢桿菌 厭氧 - - - →乳桿菌 G+球菌+麥康凱不生長+拉絲試驗陰性 觸酶 OF試驗 溶血 （+ F β/γ）→葡萄球菌屬→ 血漿凝固酶 （+ O/N – γ） →微球菌屬 （- α/β/γ溶血 ） →鏈球菌科細菌→Lancefied抗原乳膠凝集 肺炎鏈球菌乳膠凝集 凝固酶陽性葡萄球菌 凝固酶陰性葡萄球菌 CHROMagar生長，酵母樣菌落 顯微鏡觀察：真菌孢子 酵母樣真菌→ 血清芽管誘導 玉米吐溫 28℃霉菌相誘導→乳酸酚棉蘭染色 腦心浸液瓊脂酵母相誘導 試驗組合 常見組合模塊： 腸桿菌科 非發(fā)酵菌 葡萄球菌與微球菌 鏈球菌科 嗜血桿菌 奈瑟菌 念珠菌 厭氧菌 棒狀桿菌 彎曲菌 李斯特菌 芽孢桿菌 GN GP NH ANC 系統(tǒng)鑒定前的準備 儀器的準備 試劑的準備 菌懸液的準備——必須是由經(jīng)過純培養(yǎng)的菌落或者分離狀態(tài)較佳的單個菌落制備，禁止使用混合菌！ 選擇恰當?shù)慕臃N濃度 碳源氮源利用試驗、同化試驗、生長以及生長抑制試驗采用采用低接種濃度 糖分解、氨基酸分解（脫羧/脫氨）、蛋白質(zhì)分解、吲哚產(chǎn)生等，以及各種酶試驗采用高接種濃度 苛養(yǎng)菌酶法快速生化試驗采用濃厚接種，糖類需覆蓋石蠟 手工試驗（見SOP文件） API（20種）與ATB（32種） 自動化試卡/板 國產(chǎn)（上海復(fù)興、珠海迪爾、珠海美華、山東新科、合肥恒星、溫州康泰、杭州天和等15~30種） 梅里埃V2C（60種） BD phoenix100（45種） 西門子（30種） 試驗選擇 生化反應(yīng)結(jié)果的判讀 正確的孵育溫度、濕度 除特殊需要CO2的細菌外一般置普通35℃孵箱 真菌28℃孵育，注意保濕 有些細菌22℃與35℃試驗結(jié)果不同，按鑒定試劑盒規(guī)定的溫度孵育否則易得出錯誤結(jié)果 正確的孵育時間 粘液性銅綠必須48h讀取結(jié)果，其他非發(fā)酵菌最佳孵育時間為48h 真菌同化試驗必須48h讀取結(jié)果 正確的判讀方法 主要是微量生化管，以及鑒定板對弱陽性孔的解讀 細菌鑒定的質(zhì)量控制 狹義質(zhì)量控制：對試劑和儀器的控制 廣義質(zhì)量控制：對所有影響試驗結(jié)果可靠性的因素進行的全面質(zhì)量控制 試驗人員技術(shù)能力的控制——操作的標準化與試驗結(jié)果判讀的標準化 試劑的保存與正確使用 儀器的正確使用、定期維護與校準 試劑陰陽性結(jié)果的典型性與試劑的穩(wěn)定性考察 嚴格但合理的首代分離培養(yǎng)基質(zhì)控措施 流程中不同環(huán)節(jié)試驗之間的相互印證 細菌鑒定質(zhì)控中的重點 人員能力的培訓、考核與權(quán)限的授予 流程中不同環(huán)節(jié)試驗之間的相互印證 首代分離培養(yǎng)基質(zhì)控措施 試劑的正確保存與穩(wěn)定性考察 人員能力的 培訓、考核與權(quán)限的授予 在所有影響因素中，人的因素居于首位 臨床微生物檢驗是一個智力因素占首要地位的行業(yè)，是真正意義上的診斷學。在歐美從屬于臨床病理的范疇 基礎(chǔ)知識的扎實程度、臨場實踐能力的高低、自主學習能力的強弱直接影響工作質(zhì)量的好壞 個人能力在報告質(zhì)量中有直接而明顯的體現(xiàn) 人員能力的 培訓、考核與權(quán)限的授予 在微生物室對后進人員的培訓考核是一項長期任務(wù)，對于人才梯隊的形成和特殊能力的傳承有著重要意義 根據(jù)每個人員能力的層次分別授予對應(yīng)等級的權(quán)限對于控制微生物室整體質(zhì)量，防范錯誤的發(fā)生，提高報告質(zhì)量有確定的意義 流程中不同環(huán)節(jié)試驗 之間的相互印證 建立全程質(zhì)控的觀點對于提高微生物檢驗質(zhì)量意義重大 通過不同環(huán)節(jié)試驗結(jié)果之間的推衍和反證可及時發(fā)現(xiàn)一些錯誤的存在，并及時進行糾正可防止錯誤報告的發(fā)出 不同環(huán)節(jié)之間的推衍與反證可讓我們發(fā)現(xiàn)平時質(zhì)控中難以發(fā)現(xiàn)的失控現(xiàn)象，便于我們制訂相應(yīng)的規(guī)則堵住漏洞，對于工作的持續(xù)改進有著重要的意義 流程中不同環(huán)節(jié)試驗 之間的相互印證 舉例： 血液中分離到一株G-桿菌在麥康凱上不生長，含萬古霉素的巧克力上也不生長，提示Gram染色失控，將G+桿菌染成了G-桿菌，使用拉絲試驗即可驗證； 鑒定結(jié)果為醋酸鈣不動桿菌或產(chǎn)堿假單胞菌但藥敏結(jié)果亞胺配能耐藥、氨基糖苷類耐藥、復(fù)方磺胺敏感，提示細菌可能是嗜麥芽，鑒定結(jié)果結(jié)果失控，復(fù)查氧化酶試驗、賴氨酸脫羧試驗 鑒定結(jié)果為糞腸球菌，但藥敏結(jié)果萬古霉素、替考拉寧、氯霉素均耐藥，提示細菌不純，可能污染了真菌，吸取萬古霉素以及氯霉素藥敏孔中的菌液涂片高倍鏡下觀察是否有真菌孢子存在即可印證 鑒定結(jié)果為A群鏈球菌，Lancefield抗原和桿菌肽均符合鑒定，但藥敏結(jié)果青霉素耐藥，提示藥敏試劑可能失效，應(yīng)用標準菌株重新進行藥敏試劑的質(zhì)量控制 首代分離培養(yǎng)基質(zhì)控措施 目前國內(nèi)有超過10家商品成品培養(yǎng)基制造商，由于生產(chǎn)工藝簡單，技術(shù)壁壘較低，有無研發(fā)實力的公司都來趟這趟渾水，導致成品培養(yǎng)基市場非?；靵y，質(zhì)量良莠不齊 首代分離培養(yǎng)基是制約微生物檢驗陽性率的門戶，分離到細菌是一切成功檢驗的前提條件。其質(zhì)量的好壞直接影響微生物檢驗的整體質(zhì)量。在“檢驗中”階段，所有影響因素中，該因素所占的比重最大 血平板 質(zhì)控菌株：化膿性鏈、肺鏈、淋病奈瑟菌 首次評價內(nèi)容：外觀、菌落形態(tài)、GI指數(shù)、干擾回收試驗、臨床標本試用（分離能力）、穩(wěn)定性考察 平時評價內(nèi)容： 接種菌量：100~300cfu 化膿性鏈球菌 ATCC 19615：生長良好，β溶血，24 h菌落大于1.0 mm 肺炎鏈球菌 ATCC 6303：生長良好，α-溶血，24 h菌落大于2.0 mm，菌落扁平或臍窩狀 淋病奈瑟菌 ATCC 49226：生長，不溶血，24 h單個菌落大于0.5 mm，48h＞2mm 頻率：一周內(nèi)用完的培養(yǎng)基，每批一次；超過一周后，每周監(jiān)測，合格的使用，否則棄去 巧克力培養(yǎng)基 質(zhì)控菌株：流感桿菌、副流感桿菌 首次評價內(nèi)容：外觀、菌落形態(tài)、GI指數(shù)、干擾回收試驗、臨床標本試用（分離分離能力）、穩(wěn)定性考察 平時評價內(nèi)容： 接種菌量：100~300cfu 流感嗜血桿菌ATCC10211：生長良好， 24 h菌落大于2.5 mm 副流感桿菌臨床分離菌：生長良好， 24 h菌落大于2.0 mm 頻率：一周內(nèi)用完的培養(yǎng)基，每批一次；超過一周后，每周監(jiān)測，合格的使用，否則棄去 血培養(yǎng)瓶（需氧瓶） 質(zhì)控菌株：銅綠、化膿鏈、金葡、流感、白念、腦膜炎奈瑟菌（兒童瓶） 該培養(yǎng)基一般比較穩(wěn)定，只需每批做一次即可 方案： 接種量為10~100CFU/瓶 放入血培養(yǎng)儀后24內(nèi)報陽 MALDI-TOF指紋圖譜 細菌鑒定試驗、流程 與鑒定試驗的基本組合 鑒定試驗 試驗流程 試驗的選擇與組合 鑒定試驗 形態(tài)學觀察 生化反應(yīng)試驗 血清學試驗 分型試驗 血清學分型 噬菌體分型（不常用） 細菌素分型（不常用） 動物試驗（普通臨床實驗室不用） 形態(tài)學觀察 鏡下形態(tài)學觀察： 不染色標本 暗視野動力觀察 念珠菌孢子和菌絲的觀察 絲狀真菌小培養(yǎng)動態(tài)觀察 L型菌落與特殊細菌菌落解剖結(jié)構(gòu) 染色后鏡下形態(tài) Gram染色 抗酸染色 異染顆粒染色 熒光染料染色 熒光抗體染色 乳酸酚棉蘭染色 墨汁染色 形態(tài)學觀察 菌落形態(tài)觀察： 大?。毴玑樇狻⑿?、中等、大） 質(zhì)地（堅硬、干燥、濕潤、水滴狀） 光滑程度（粗糙、光滑、粘液型） 凹凸（扁平、微凸、凸起、中性凹陷） 顏色（白色、灰色、黃色、綠色、紅色、黑色等） 透明程度（透明、半透明、不透明） 邊緣（整齊、星狀、有偽足、楓葉狀、樹葉狀等） 溶血性（α、β、γ） 其他、瓊脂凹陷、氣生菌絲、菌落背面顏色、菌落特殊氣味等 形態(tài)學觀察 營養(yǎng)需求（血瓊脂、巧克力、營養(yǎng)瓊脂生長情況） 膽鹽耐受（麥康凱生長情況） 萬古霉素耐受（含萬古霉素巧克力生長情況） 液體培養(yǎng)基生長現(xiàn)象（菌膜、上半部生長、均勻渾濁、下半部生長、沉淀） 半固體動力現(xiàn)象（清晰、毛刷樣、倒傘狀） 生化反應(yīng) OF試驗 各種糖發(fā)酵試驗、糖氧化試驗 糖衍生物發(fā)酵（α/β-甲基葡萄糖、β-葡萄糖胺、β-葡萄糖醛酸等） 淀粉、糖原水解 七葉苷水解 甲基紅與VP試驗 甘油復(fù)紅 2-酮基葡萄糖酸鹽還原試驗 蛋白質(zhì)代謝試驗 明膠水解 石蕊牛乳液化（酪蛋白水解） 凝固血清液化（肽酶） 氨基酸水解試驗 脫羧酶（精、鳥、賴） 脫氨酶（苯丙氨酸、色氨酸） 精氨酸雙水解 尿素水解 吲哚產(chǎn)生 H2S產(chǎn)生 碳源、氮源利用試驗 常用的有枸櫞酸鹽、醋酸鹽、丙二酸鹽、蘋果酸鹽（觀察方法有同化和分解兩種） 其他包括各種糖類、有機酸鹽、各種氨基酸和胺類（只觀察同化現(xiàn)象） 馬尿酸水解試驗 硝酸鹽還原、產(chǎn)氣試驗 膽汁溶菌試驗 拉絲試驗 多糖合成試驗 酶類試驗 氧化酶 酚氧化酶 改良氧化酶 觸酶 耐熱觸酶 Superoxol試驗 凝固酶 DNA酶 玉米脂酶 吐溫水解 卵磷脂酶 磷酸酶 鏈激酶 芳氨酶（肽酶） 吐溫水解 糖苷酶（如OPNG） 各種芳氨酶及其檢測底物 特殊診斷紙片鑒定法 Optochin敏感試驗 桿菌肽敏感試驗 復(fù)方新諾明敏感試驗 O129敏感試驗 新生霉素敏感試驗 溶菌酶敏感試驗 生長以及生長抑制試驗 KCN抑制試驗 0%NaCl生長試驗 6.5%NaCl耐受試驗 亞碲酸鉀還原試驗 4℃生長試驗 42℃生長試驗 55℃生長試驗 血清學試驗（常用） 鏈球菌Lancefield抗原分型乳膠試劑 肺炎鏈球菌乳膠試劑 MRSA乳膠試劑 嗜肺軍團菌分型血清 沙門菌血清 志賀菌血清 EPEC、EIEC、ETEC、O157:H7血清 霍亂弧菌分型血清 血清學試驗（不常用） 銅綠假單胞菌生物分型血清 腦膜炎奈瑟菌分型血清 隱球菌可溶血抗原血清 腦膜炎5種可溶性抗原復(fù)合乳膠 b型流感嗜血桿菌乳膠 肺炎鏈球菌乳膠（含83個血清型的多價血清） A群腦膜炎奈瑟菌乳膠 B群腦膜炎奈瑟菌/大腸埃希菌K1乳膠 C群腦膜炎奈瑟菌乳膠 血清學試驗（不常用） B群鏈球菌乳膠 布魯菌抗體檢測乳膠 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分型血清 白喉抗毒素檢測 肺炎鏈球菌莢膜腫脹試驗 肥大外菲試驗 試驗流程 第一步：形態(tài)學試驗 第二步：快速定向試驗 第三步：系統(tǒng)生化鑒定 第四步：血清學分型試驗 第五步：特定細菌的抗生素天然敏感、天然耐藥反證法鑒定 形態(tài)學試驗 G+菌 BA生長、Choc不生長、MecK不生長，——Gram染色：分G+co（革蘭陽性球菌） ,G+ b（革蘭陽性桿菌） G+co—依靠溶血特征，菌落形態(tài)、菌落顏色、菌體形態(tài)區(qū)分: ▲葡萄球菌：淡黃色/白色，中等大小，較凸，規(guī)則圓形，β/γ溶血，較濕潤，除金黃色葡萄球菌外，一般不具有臨床意義； ▲微球菌：黃色/白色/橙色，中等大小，較凸，規(guī)則圓形，不溶血，較干燥，不易乳化較葡萄球菌生長緩慢，該菌一般無臨床意義； ▲鏈球菌：白色/灰白色、凸起小菌落，β溶血為溶血型鏈球菌，其中化膿性鏈球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌菌落相對較大（多在1.0mm左右），而咽峽炎鏈球菌，馬鏈球菌等菌落則較?。ǘ嘣?.5mm左右）；灰白隆起中心扁平或凹陷，1.0-1.5mm大小的寬大а溶血為肺炎鏈球菌；細如針尖，白色凸起а溶血的為草綠色鏈球菌； ▲氣球菌：白色凸起小菌落，а溶血，1.0mm左右，有特殊氣味（酷似乙醛），菌落較草鏈大。鏡下為短鏈或葡萄球菌樣排列，菌體大而著色不均 ▲腸球菌：灰白，低凸，2.0mm左右之а溶血菌落，較濕潤； ▲口腔球菌：白色凸起較大菌落，不溶血，黏著，接種針挑之則整個菌落挑起，瓊脂上不留痕跡。 ▲孿生球菌：白色小菌落，β/γ溶血，菌落黏著不易刮取，但在鹽水中易乳化，較濕潤，在質(zhì)量較好的新鮮血瓊脂或哥倫比亞血瓊脂上易生長，在含血MHA上不生長。 G+ b—依靠溶血特征，菌落形態(tài)、菌落大小、菌體形態(tài)區(qū)分： ▲棒狀桿菌：白色1.0-1.5mm左右大小，較干燥，不溶血/狹窄β溶血的為白喉或一般棒狀桿菌；小而濕潤，灰白/無色，半透明的為J-K棒狀桿菌；灰白細小，β溶血的可能為化膿放線菌、溶血分泌桿菌； ▲芽孢桿菌：灰白大菌落，表面粗糙如毛玻璃狀、蠟狀、邊緣不規(guī)則，不同種類菌落形態(tài)差異巨大，寬大β溶血。延長培養(yǎng)時間，菌落從濕潤變得干燥，邊緣呈放射狀擴散，形成葉狀、掌狀、雪花狀、齒輪狀等； BA生長、Choc生長、MecK不生長，——Gram染色：分G+co及G+b ▲ G+co：平面球菌、藻球菌：血瓊脂上為а溶血，0.5-1.0mm大小，在Choc上呈現(xiàn)金屬色澤。 ▲ G+b：乳桿菌：細小，白色凸起а溶血菌落，有特殊的酸臭味； BA生長、Choc生長、MecK生長，——Gram染色：G- b—氧化酶、麥康凱瓊脂顏色 ▲腸桿菌：氧化酶（-），麥康凱瓊脂上紅色色/粉紅色/無色濕潤大菌落； ▲弧菌：氧化酶（+），麥康凱瓊脂上紅色/無色不透明扁平大菌落； ▲非發(fā)酵菌：氧化酶（+/-），麥康凱瓊脂上無色透明小菌落—鮑曼不動桿菌為中等大小，菌落聚集處橙紅色，單個菌落為橙色 BA緩慢生長、Choc緩慢生長、MecK不生長，——Gram染色：分G-b及G-cob： ▲HACEK族：嗜沫/副嗜沫嗜血桿菌（巧克力上生長良好）、艾肯氏菌、碳酸噬胞菌、放線桿菌、金氏菌（ G-cob ）； ▲心桿菌：人類心桿菌； ▲鞘氨醇單胞菌：少動鞘氨醇單胞菌； ▲莫拉菌（ G-cob ）：缺陷莫拉菌、非液化莫拉菌、奧斯陸莫拉菌； ▲寡源菌； ▲黃桿菌及相關(guān)種：包括鞘氨醇桿菌、產(chǎn)吲哚金色桿菌、黏液威克菌、動物傷口伯杰氏菌、短穩(wěn)桿菌等； ▲甲基桿菌：嗜中溫甲基桿菌； ▲巴斯德菌； ▲鮑特氏菌：百日咳鮑特氏菌，培養(yǎng)基需含淀粉或活性炭； ▲弗朗西絲菌：對L-半胱氨酸有特殊需求 G-co：氧化酶（+）、觸酶（+） ▲奈瑟菌：白色/黃色中等大小菌落，光滑或皺褶，一般菌落比較干燥； ▲卡他莫拉菌：白色小菌落（24h內(nèi)），菌落有脆性，用接種環(huán)推之可移； BA不生長/細小、Choc生長、MecK不生長，——Gram染色：G-b、菌體細小或呈扭曲之長絲狀 ▲嗜血桿菌： 灰色/無色，半透明，1.5-2.0mm的多為流感嗜血桿菌； 灰色略黃，不透明，1.0-1.5mm的多為副流感嗜血桿菌； 在血瓊脂上做衛(wèi)星試驗時出現(xiàn)β-溶血的多為溶血嗜血桿菌； 生長緩慢（48h肉眼可見）多為杜克雷嗜血桿菌或緩慢嗜血桿菌 BA不生長、Choc不生長、MecK不生長、BCYE-а生長/或在含有L-半胱氨酸、鐵離子、復(fù)合抗生素選擇劑的強化血瓊脂上生長—Gram染色：G-b、菌體細、長絲狀 ▲提示可能為軍團菌：該菌在BCYE-а上48~72 h為中等大小扁平菌落，灰白色，表面呈毛玻璃樣 真菌及奴卡菌 BA、Choc、CHROMagar均生長—生長速度較細菌慢，Gram染色形態(tài)比較特殊；奴卡菌尚具有弱抗酸性 真菌 ▲酵母樣真菌：菌落中等大小不透明，具有酵味，多數(shù)可在CHROMagar上顯色； ▲曲霉菌：絲狀真菌菌落，35℃培養(yǎng)24~48h時菌落為白色泛綠，72h后菌落迅速轉(zhuǎn)為褐色，中心粉末狀背面為黃褐色如煙熏狀 ▲鐮刀菌：絲狀真菌菌落，35℃不生長，28℃ 3~5天形成白色到淡黃色大菌落，稀疏絨毛狀 ▲其他真菌：菌落形態(tài)見真菌專著 奴卡菌 ▲ 小菌落，生長慢，菌落皺褶，呈顆粒狀，有時產(chǎn)生褐色、黃色、黑色等色素。瓊脂凹陷。菌落特別硬，接種環(huán)難以刮取。有的種5天后又氣生菌絲形成 盧先雷 概論 學習本課件我們主要掌握和了解的內(nèi)容： 什么是細菌系統(tǒng)鑒定？ 細菌系統(tǒng)鑒定與細菌系統(tǒng)分類學 細菌系統(tǒng)鑒定手段（方法學） 細菌系統(tǒng)鑒定流程與鑒定試驗的基本組合 鑒定試驗的質(zhì)量控制 小結(jié)與練習 細菌系統(tǒng)鑒定的定義 以細菌系統(tǒng)分類學為原則，根據(jù)細菌某些生物學性狀的差異，挑選一些具有較高鑒別作用的試驗，經(jīng)過精簡與優(yōu)化組合，用以測定未知細菌，得出試驗結(jié)果，再與已知細菌數(shù)據(jù)庫進行比較，從而推斷未知細菌在分類體系中位置的方法。 細菌鑒定是細菌分類學的一種實踐應(yīng)用，要掌握細菌鑒定，必須掌握系統(tǒng)分類學。 細菌系統(tǒng)分類學 細菌系統(tǒng)分類學是為研究目前已知細菌在親緣關(guān)系上遠近程度而建立起來的一整套分類方案。 使用該方案我們不僅可以了解一株未知分離菌在已知分類單元中的最佳匹配位置，還可以快速而準確的發(fā)現(xiàn)新種，并將之歸入對應(yīng)的位置。 細菌系統(tǒng)分類學的經(jīng)典書籍 BERGEY’S MANUAL OF Systematic Bacteriology（《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》）是研究細菌系統(tǒng)分類學的全球經(jīng)典書籍 細菌分類單元 細菌系統(tǒng)分類法 傳統(tǒng)分類法 林奈分類原理：偏重原理 數(shù)值分類法 100~200項生理生化特征相似度（百分率）：等重原理 綜合分類法 生理生化、遺傳物質(zhì)、化學分子比較等手段綜合應(yīng)用 細菌系統(tǒng)分類學手段 表型特征分類 形態(tài)學分類 生物化學代謝途徑分類 噬菌體生物學分類 遺傳特征分類 DNA結(jié)構(gòu)分類 RNA結(jié)構(gòu)分類 分子結(jié)構(gòu)分類 抗原抗體血清學分類 細胞壁多糖分子與肽聚糖結(jié)構(gòu)分類 細胞壁脂肪酸結(jié)構(gòu)和組成分類 細胞壁蛋白電泳分類 細菌之間親緣關(guān)系表示方法 相似系數(shù)矩陣圖（數(shù)值分類法） 樹狀拓撲學（綜合分類法） 系統(tǒng)發(fā)育樹 放射樹 基礎(chǔ)樹 生物群落圖（新的表示方法，尚未一致認可） 相似系數(shù)矩陣圖 樹狀拓撲學 細菌鑒定手段（方法學） 細菌鑒定的基本思想方法基于分類學 所采用的鑒定試驗取自于分類學，根據(jù)被研究對象群體的不同，挑選和優(yōu)化組合，選擇出適合于臨床實驗室操作的鑒別能力強、可行性高的試驗用于鑒定 根據(jù)試驗的選擇組合與這些試驗操作時具體的指導思想方法、應(yīng)用流程，以及借助工具的不同將細菌鑒定方法分成了幾個不同階段 不同種群的細菌根據(jù)培養(yǎng)的難易以及實際操作時的難度而采用不同的鑒定手段 目前技術(shù)能培養(yǎng)的細菌采用傳統(tǒng)手段 難培養(yǎng)細菌采用分子生物學手段（如麻風分支桿菌、肺炎支原體、肺炎衣原體等） 而傳統(tǒng)手段難以進一步鑒定的細菌則采用抗原抗體血清學分類（如軍團菌、沙門菌、志賀菌等）、細胞壁脂肪酸結(jié)構(gòu)和組成分類（如棒狀桿菌相關(guān)屬）、揮發(fā)性代謝產(chǎn)物（如厭氧菌揮發(fā)性脂肪酸）指紋分析 其他：如細胞壁蛋白電泳分類、細胞壁多糖分子與肽聚糖結(jié)構(gòu)分類等 細菌鑒定方法學分類 傳統(tǒng)手段——表型鑒定 分子生物學手段——基因型鑒定 抗原抗體、細胞壁成分、代謝產(chǎn)物指紋等手段——分子鑒定 細菌表型鑒定方法學 表型鑒定方法學分類與歷程： 傳統(tǒng)林奈雙岐圖表法 雙歧索引法 表解法 數(shù)字編碼鑒定法 手工查表 儀器鑒定 酶速率法 可見光色源酶底物——梅里埃V2C 熒光色源酶底物——BD Phoenix 100快速卡 數(shù)字編碼鑒定法原理 1、形成數(shù)據(jù)庫 2、將試驗結(jié)果轉(zhuǎn)化為反應(yīng)數(shù)值 3、分別計算每個分類單元出現(xiàn)所測定反應(yīng)譜型的概率 4、計算鑒定符合百分率（id%）與模式頻率（T值） 5、根據(jù)id%、相鄰id%比值、T值進行降序排序 6、結(jié)果評價 1、儀器只顯示唯一結(jié)果，說明結(jié)果該鑒定能到到種的水平 2、如果提示兩個以上結(jié)果，但都是同一個屬的細菌。則說明該鑒定只能達到屬的水平 3、如果鑒定id%＜80%，則結(jié)果不可靠 4、如果儀器提示結(jié)果不可接受，則說明 1）試條/卡選擇錯誤 2）分離菌不適合采用該方法 3）菌不純，特別是顯示出大于兩項生化反應(yīng)結(jié)果不符合時。 酶速率法 梅里埃VITEK2 compact 可見光色源酶底物如對硝基苯胺（金黃色）作為呈色基團 BD Phoenix 100快速卡 熒光色源酶底物如熒光香豆素、4-甲基-7-羥基-香豆素衍生物，可見光色源如對硝基苯胺（金黃色）作為呈色基團 原理：底物-色源復(fù)合物 無色 游離色源 待檢酶 水解底物 酶速率法原理 V Δy/Δx tanα OD t cutoff V＞cutoff “+” V＜cutoff “-” α MALDI-TOF 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間 原理：檢測來自完整細菌的蛋白質(zhì)構(gòu)成。先將待測樣本與基質(zhì)混合，均勻涂布在樣品板上，放入MS儀器?；|(zhì)吸收來自激光的能量，與樣本一起蒸發(fā)，與此同時將樣本電離。帶電樣本通過電場進入飛行時間檢測器，離子依質(zhì)荷比不同而分離，最終可以在飛行管的末端檢測到每個離子的豐度。 通過查閱比對內(nèi)置指紋圖譜數(shù)據(jù)庫即可得出鑒定結(jié)果 * * |
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