摘  要：兔皮膚真菌病近年來在我國各地流行嚴(yán)重，其病原菌靠傳統(tǒng)的表型特征鑒定難以區(qū)分，本文從浙江、江蘇等各地發(fā)病的21個(gè)兔場(chǎng)各品種兔中通過培養(yǎng)分離純化出17株真菌，在培養(yǎng)特性等表型特征初步鑒定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步建立了PCR快速診斷技術(shù)，通過基因擴(kuò)增和序列測(cè)定，能夠正確作出鑒別診斷，分別鑒定出須癬毛癬菌10株、犬小孢子菌5株和趾間毛癬菌2株，其擴(kuò)增的基因片段大小分別為692bp、741bp和708bp。

關(guān)鍵詞：兔皮膚真菌??；真菌；PCR；診斷

近年來在全國各地流行的兔皮膚真菌病是我國當(dāng)前危害養(yǎng)兔業(yè)最為嚴(yán)重的皮膚病，發(fā)病率可達(dá)30%～95％，發(fā)病死亡率可達(dá)10%～30％，各地兔場(chǎng)均有發(fā)生，各品種兔均能發(fā)病，兔場(chǎng)一旦感染，由于該病的頑固性，便很快傳遍整個(gè)兔場(chǎng)，嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)性能及皮毛的質(zhì)量，從而影響?zhàn)B殖者的經(jīng)濟(jì)效益。為此，很多學(xué)者開展了對(duì)該病的研究，取得了很大的進(jìn)展，但仍然有許多問題拯待解決，其中病原方面的，由于其直接暴露于空氣中，因此病原復(fù)雜，到底是單一的病原真菌還是多病原感染，因此需要一種能及時(shí)快速作出診斷的方法，為此我們根據(jù)分離的病原真菌中，在培養(yǎng)特性等表型方面作出初步鑒定的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了引物，進(jìn)一步建立了PCR快速診斷技術(shù)，能夠快速、正確的作出診斷，為該病提供相應(yīng)的防治技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1  材料和方法

1.1  皮膚真菌病病原分離鑒定

1.1.1  皮膚真菌病原分離  赴浙江省的建德、寧波、臨海、嵊州、新昌、嘉善、桐鄉(xiāng)及江蘇等地發(fā)病的兔場(chǎng)，對(duì)發(fā)病的獺兔、肉兔、長(zhǎng)毛兔等病兔在病變部位采用酒精消毒，在病健交界處用消毒眼科鑷子夾取結(jié)痂的皮屑置于TSA培養(yǎng)基上，于28℃、濕度75％的真菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5～7天后觀察結(jié)果，并據(jù)培養(yǎng)情況進(jìn)一步分離純化。

（2）分離病原真菌表型初步鑒定

分離純化培養(yǎng)后，觀察菌落的形態(tài)、大小、色彩；進(jìn)而在顯微鏡下觀察菌體、菌絲、孢子的形態(tài)特征，明確其培養(yǎng)特性、生長(zhǎng)特性、形態(tài)特征等表型特征，初步鑒定出其種類。

2  皮膚真菌病PCR快速診斷技術(shù)

用TSA培養(yǎng)基培養(yǎng)分離鑒定的病原真菌，在真菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3－5天后，用液氮法提取基因組DNA，根據(jù)相關(guān)霉菌已知的基因序列設(shè)計(jì)ITS引物，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出分離菌的基因，優(yōu)化基因組DNA提取和基因擴(kuò)增條件，建立起皮膚真菌病PCR快速診斷技術(shù)。

2.1  真菌基因組DNA提取方法

在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)分離鑒定的病原菌，在真菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3－5天后，用無菌接種環(huán)從固體培養(yǎng)基上挑取菌苔于研缽中，加入少量液氮，用研磨棒稍加研磨，然后在研缽中加入1mL 10%（w/v）的Chelex-100 溶液，在旋渦混合器上振蕩5s，沸水浴10min，冷卻至室溫后12,000r/min離心15min，轉(zhuǎn)移上清置于-20℃凍存?zhèn)溆?，上清即可作?/span> PCR的模板。

2.2  引物設(shè)計(jì)

根據(jù)基因庫已知的序列設(shè)計(jì)以下通用引物：

TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS1   5’-3’

TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS4    5’-3’

2.3  rDNA-ITS PCR反應(yīng)體系及操作程序

50 μl 反應(yīng)體系：2 μl DNA原液，25 μl 2×EasyTaq PCR Super Mix 溶液，引物各2 μl（20umol/L），ddH2O19 μl。反應(yīng)在PE-9600 型PCR 儀上進(jìn)行，程序?yàn)椋?/span>95℃變性 3min；94℃變性1min，55℃復(fù)性 1min，72℃延伸 1.5min；進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。反應(yīng)完成后，取5 μlPCR 產(chǎn)物在 2%瓊脂糖凝膠100V 電泳，260nm 紫外燈下觀察結(jié)果，并對(duì)PCR產(chǎn)物送檢測(cè)序。

3  結(jié)果

3.1  皮膚真菌病病原分離及表型初步鑒定結(jié)果

在浙江省的建德、寧波、臨海、嵊州、新昌、嘉善、桐鄉(xiāng)及江蘇等發(fā)病的21個(gè)兔場(chǎng)中，分別從肉兔、獺兔、長(zhǎng)毛兔等各品種病兔中分離到真菌17株，分屬于須癬毛癬菌10株、犬小孢子菌5株和趾間毛癬菌2株。其中分離到最多的致病菌是須癬毛癬菌（又稱石膏樣毛癬菌），幾乎每個(gè)兔場(chǎng)中均能分離到，其次為犬小孢子菌和趾間毛癬菌。見圖1。

3.1.1  須癬毛癬菌表型特征  須癬毛癬菌表型特征主要為：恒溫箱中培養(yǎng)72h后，TSA瓊脂上能看到培養(yǎng)基表面長(zhǎng)出雪花狀菌落，至第6天長(zhǎng)出霉菌樣菌落。菌落大小直徑約0.5～lcm，呈不規(guī)則形態(tài)，菌落頂部呈白色粉末狀，菌落扁平微隆起，邊緣呈輻射狀向外生長(zhǎng)；菌落背面呈棕褐色；菌落下層致密，質(zhì)地較硬。

用接種環(huán)挑取菌落，置于少許生理鹽水的玻片上，于顯微鏡下觀察，可見多量的菌絲和孢子，有的成串，呈粟粒樣；菌絲細(xì)長(zhǎng)有節(jié)，有的呈螺旋狀，菌絲上有小梗；小分生孢子多量，單個(gè)或成叢，形態(tài)近乎圓形或橢圓形；大分生孢子很少。根據(jù)這些表型特征，初步鑒定為須癬毛癬菌。

3.1.2  犬小孢子菌表型特征  犬小孢子菌表型特征主要為：恒溫箱中培養(yǎng)72小時(shí)后，TSA瓊脂上能看到培養(yǎng)基表面長(zhǎng)出雪花狀的菌落，至第6天長(zhǎng)出大菌落，生長(zhǎng)非常迅速，菌落直徑大于5cm，呈不規(guī)則圓形，菌落中部比周邊低，周邊蓬松上翹，并呈羽毛飄逸狀往周邊生長(zhǎng)，正面呈白色羽毛狀；菌落背面也呈白色。根據(jù)菌落的表型特征，初步鑒定為犬小孢子菌。

3.1.3  趾間毛癬菌  TSA培養(yǎng)基上28℃、濕度75％的真菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5～7天后觀察菌落，大小直徑約0.5～lcm，呈規(guī)則圓形，饅頭狀隆起，菌落頂部孢子呈粉紅色粉末狀，與周邊色差分明，個(gè)別菌落上摻雜著黑色孢子的顏色；菌落周邊主要為菌絲，呈白色；菌落背面呈白色；根據(jù)菌落的表型特征，初步鑒定為趾間毛癬菌。

由上可見，雖然能從菌落的大小、生長(zhǎng)形態(tài)、顏色等基本表現(xiàn)作出初步判斷，但由于有些真菌的生長(zhǎng)形態(tài)等表型特征非常相似，相互間很難作出正確的區(qū)分，因此要作出正確的鑒定，必須從分子生物，特別是采用PCR的技術(shù)，對(duì)分離菌作出最終的鑒定。

4  兔皮膚真菌病原菌PCR快速診斷技術(shù)

用TSA培養(yǎng)基培養(yǎng)已分離純化的病原真菌，在真菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3－5天后，用接種環(huán)無菌挑取菌苔于研缽中，用液氮法提取基因組DNA，根據(jù)設(shè)計(jì)的通用引物ITS及相應(yīng)的PCR操作程序，對(duì)根據(jù)表型初步鑒定的3種真菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。

收集擴(kuò)增后的產(chǎn)物送檢生物公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果如下圖3：

根據(jù)測(cè)序結(jié)果表明，大小分別為692bp、741bp和708bp，通過基因Bank的BLAST軟件進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明分別為須癬毛癬菌、犬小孢子菌和趾間毛癬菌。再與表型鑒定相結(jié)合，作出相應(yīng)的鑒定結(jié)果，分別為須癬毛癬菌10株、犬小孢子菌5株和趾間毛癬菌2株。

研究結(jié)果表明，建立的PCR技術(shù)能夠快速、敏感、準(zhǔn)確地鑒定出兔皮膚真菌病原菌。

5  結(jié)論和討論

根據(jù)以上結(jié)果，分離鑒定的兔皮膚真菌病病原菌，在培養(yǎng)純化后，從形態(tài)、生長(zhǎng)特性、色澤、大小等表型特征作出初步的判斷，但由于真菌種類繁多，空氣中本身就有很多非病原真菌的存在，而且很多病原真菌在形態(tài)等表型特性上很相似，單憑表型特征很難進(jìn)行區(qū)分，如須癬毛癬菌和趾間毛癬菌，菌落形態(tài)非常相似，無法區(qū)分，因此必須采用分子生物學(xué)的技術(shù)手段才能作出正確的鑒定，本文建立的PCR診斷方法能有效鑒別出須癬毛癬菌、犬小孢子菌和趾間毛癬菌，基因片段大小分別為692bp、741bp和708bp。

從浙江、江蘇等省的21個(gè)兔場(chǎng)中共分離出17株菌病原真菌，通過表型判斷及PCR鑒定結(jié)果，共鑒定出須癬毛癬菌10株（又稱石膏樣毛癬菌）、犬小孢子菌5株和趾間毛癬菌2株。這個(gè)結(jié)果與各地學(xué)者報(bào)道的基本一致，感染最多的是石膏樣毛癬菌，幾乎每個(gè)兔場(chǎng)、不同的品種中均能分離到該菌，說明其是主要致病菌，但分離鑒定的其它幾種菌，如犬小孢子菌、趾間毛癬菌報(bào)道的很少，其致病性的強(qiáng)程度有待進(jìn)一步的人工發(fā)病試驗(yàn)，以證實(shí)其致病性及毒力。

建立的PCR檢測(cè)方法能有效鑒定不同的菌屬種類，因此建立的方法是一種準(zhǔn)確、快速、敏感的診斷方法。由于真菌孢子的壁比較硬，用常規(guī)提取細(xì)菌DNA的方法可行性比較差，我們嘗試過用超聲等提取基因組的方法，結(jié)果都不理想，后來改用液氮預(yù)處理的方法，結(jié)果表明效果良好。

參考文獻(xiàn)：

[1]韋強(qiáng)　肖琛聞　季權(quán)安　劉燕　鮑國連等，兔皮膚真菌病流行病學(xué)調(diào)查及病原分離鑒定，中國養(yǎng)兔，2014,202（4）:25-27.

[2]劉彥威，劉　娜，兔須癬毛癬菌分類研究進(jìn)展，動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013,34(5)：107-109.

[3]崔麗娜，高淑霞，姜文學(xué)，楊麗萍等，山東兔場(chǎng)皮膚真菌病病原rDNA-ITS區(qū)序列測(cè)定及分析，中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,31(12):1749-1754.

[4]趙長(zhǎng)城，訾士魯，李福寶.兔皮膚真菌病的流行病學(xué)和診斷.[J]動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005,27(1)：104-107.

[5]劉德昊，楊光友，賴松家,等.四川地區(qū)兔脫毛癬病的病原學(xué)研究.[J]中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，28（6）：622-624.