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時(shí)間：2013-4-12編輯：夏小希
作者：莊輝 翁心華來源：1. 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病原生物學(xué)系和感染病中心
導(dǎo)語：中國國家食品藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)4類核苷和核苷酸類藥物 (NAs) 用于慢性乙型肝炎患者 (CHB) 治療。用這些藥物可對CHB患者進(jìn)行有效治療，但常發(fā)生乙型肝炎病毒 (HBV) 對這些NAs發(fā)生耐藥，導(dǎo)致治療失敗和疾病進(jìn)展。本文綜述了HBV對NAs的耐藥機(jī)制，以及專家對耐藥管理和預(yù)防的共識(shí)。
核苷和核苷酸類藥物治療慢性乙型肝炎的耐藥及其管理
莊輝1 翁心華2
1. 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病原生物學(xué)系和感染病中心, 北京 100191；2. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科，上海 200040
摘要：中國國家食品藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)4類核苷和核苷酸類藥物 (NAs) 用于慢性乙型肝炎患者 (CHB) 治療。用這些藥物可對CHB患者進(jìn)行有效治療，但常發(fā)生乙型肝炎病毒 (HBV) 對這些NAs發(fā)生耐藥，導(dǎo)致治療失敗和疾病進(jìn)展。本文綜述了HBV對NAs的耐藥機(jī)制，以及專家對耐藥管理和預(yù)防的共識(shí)。
關(guān)鍵詞：乙型肝炎, 慢性；耐藥；核苷和核苷酸類藥物；管理
中圖分類號(hào)：R512.6+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：
Drug resistance to nucleoside and nucleotide analogs in chronic hepatitis B and its management
ZHUANG Hui1, WENG Xin-hua2
1. Department of Microbiology and Infectious Disease Center, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center, Beijing 100191, China；
2. Department of Infectious Diseases, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040，China
Corresponding authors: ZHUANG Hui, E-mail: zhuangbmu@126.com; WENG Xin-hua,
3. Abstract: Four nucleos(t)ide analogs (NAs) have been approved by the Food and Drug Administration, China for treatment of patients with chronic hepatitis B (CHB) . The patients can be successfully treated using nucleos(t)ide analogs (NAs), but drug-resistant hepatitis B virus (HBV) mutants frequently arise, leading to treatment failure and progression of the disease. This paper has reviewed the mechanisms of resistance to NAs, and consensus on the management and prevention of HBV resistance to NAs. 通訊作者：莊輝, 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病原生物學(xué)系和感染病中心，北京 100191，E-mail：zhuangbmu@126.com；翁心華，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科，上海 200040，E-mail：http://www.woyoushebao.com/mailto:xinhua_weng@fudan.edu.cn
Key word：Hepatitis B, chronic; Drug resistance; Nucleoside and nucleotide analogs; Management
在核苷和核苷酸類藥物 (nucleoside and nucleotide analogs, NAs) 治療慢性乙型肝炎過程中，耐藥是一個(gè)極為重要的問題。與未發(fā)生耐藥的患者比較，耐藥不僅可導(dǎo)致疾病進(jìn)一步進(jìn)展，并可增加發(fā)生肝功能失代償和肝細(xì)胞癌 (HCC) 的風(fēng)險(xiǎn)；還會(huì)加大后續(xù)治療的難度，增加長期治療的醫(yī)療成本。因此，耐藥的預(yù)防和管理是提高療效、縮短療程、改善預(yù)后和減少醫(yī)療成本的重要措施。近年來，我國、亞太、歐洲和美國肝病學(xué)會(huì)先后對慢性乙型肝炎診治指南或共識(shí)進(jìn)行了更新，對NAs耐藥的預(yù)防和管理提出了新的認(rèn)識(shí)和建議[1-4]。2008年我國有關(guān)專家曾發(fā)表《乙型肝炎病毒耐藥專家共識(shí)》(以下簡稱《共識(shí)》)[5]，并在2009年更新[6]，國內(nèi)許多專家曾對此《共識(shí)》提出寶貴的意見和建議，并對目前我國慢性乙型肝炎抗病毒治療中較為普遍存在的耐藥問題感到擔(dān)憂。因此，由
《中國病毒病雜志》、《中華傳染病雜志》、《肝臟》和《臨床肝膽病雜志》發(fā)起，《傳染病信息》、《Infection International (electronic edition)》、《實(shí)用肝臟病雜志》、《中國病原生物學(xué)雜志》、《中國肝臟病雜志 (電子版)》、《中國實(shí)用內(nèi)科雜志》、《中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志》、《中華肝臟病雜志》、《中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志 (電子版)》和《中華臨床感染病雜志》參加，組織專家撰寫《核苷和核苷酸類藥物治療慢性乙型肝炎的耐藥及其管理》一文。
1 核苷和核苷酸類藥物耐藥現(xiàn)狀及危害
目前我國用于治療慢性乙型肝炎的NAs主要有4種：拉米夫定 (LAM)、阿德福韋酯 (ADV)、替比夫定 (LdT) 和恩替卡韋 (ETV)。在歐美及亞洲的一些國家和地區(qū)，還有替諾福韋酯 (TDF) 等。由于不同NAs的抗病毒效力和耐藥基因屏障 (genetic barrier) 不同，這些藥物長期治療的耐藥率差異顯著。根據(jù)現(xiàn)有臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)，對于初治慢性乙型肝炎患者，LAM治療1年的耐藥率為24%，治療5年的耐藥率高達(dá)70%[7-9]。LdT治療2年，HBeAg陽性和陰性慢性乙型肝炎患者的耐藥率分別為25%和11%[10-11]。ADV治療5年，HBeAg陽性和陰性慢性乙型肝炎患者的累積耐藥率分別為42%和29% [12-13]。我國報(bào)道，ADV治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者5年累積耐藥率為14.6%[14]。日本和中國香港報(bào)道，ETV治療3年時(shí)的耐藥率為1.7%和1.2%[15-16]。 TDF的2次III期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，426例慢性乙型肝炎患者 (其中176例HBeAg陽性，250例HBeAg陰性) 用TDF單藥治療至144周時(shí)，34例 (8%) HBV DNA水平3400拷貝/ml (69 IU/ml)_，其中10例于32~120周間停用TDF，20例于72~96周間加用恩曲他濱，4例HBV DNA水平3400拷貝/ml (69 IU/ml)，但均未檢測到相關(guān)的耐藥位點(diǎn)突變[17]。
目前，我國慢性乙型肝炎抗病毒治療的耐藥問題較為嚴(yán)重。如在NAs治療中，存在多種不規(guī)范的治療情況，包括單藥隨意序貫、短期內(nèi)頻繁換藥或加藥，以及耐藥后不合理加藥或換藥等。在歐洲、美國、日本和韓國等國家和地區(qū)，NAs初治患者中，高效、低耐藥NAs使用比例達(dá)80%~90%，而在我國大陸，81%的患者仍用低效、高耐藥NAs初始治療，其中30%使用LAM，35%使用國產(chǎn)ADV。對我國大陸110個(gè)城市741家醫(yī)院的684份有效問卷分析顯示，LAM經(jīng)治慢性乙型肝炎患者占39.6%[18]。這除與我國患者的經(jīng)濟(jì)條件有關(guān)外，還與醫(yī)務(wù)人員對耐藥重要性的認(rèn)識(shí)不足有關(guān)。
NAs治療長期抑制病毒復(fù)制，能減輕肝細(xì)胞炎癥壞死及肝纖維化，從而延緩和減少肝臟失代償、肝硬化、肝癌及并發(fā)癥的發(fā)生[19-21]。Sung等[21]的薈萃分析顯示，與不治療相比，用LAM治療能使HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)降低78% (相對風(fēng)險(xiǎn)為0.22)。與未發(fā)生耐藥患者比較，耐藥不僅使已取得的治療效果 (如組織學(xué)改善) 喪失，還可導(dǎo)致肝臟病變急劇惡化，使疾病加速進(jìn)展為肝衰竭，增加肝移植率、HCC發(fā)生率和病死率[9, 22-25]。同時(shí)，交叉耐藥、多藥耐藥等使后續(xù)治療方案變得更為復(fù)雜和困難，并可能增加發(fā)生終末期肝病的風(fēng)險(xiǎn)。
2 核苷和核苷酸類藥物耐藥及應(yīng)答的相關(guān)定義
2.1原發(fā)耐藥突變 (primary drug resistance mutation) 藥物作用靶點(diǎn)的基因及其編碼的氨基酸發(fā)生突變，導(dǎo)致突變的病毒株對治療藥物的敏感性下降。原發(fā)耐藥突變株對藥物的敏感性降低，但其復(fù)制能力低于野毒株[26]。
2.2 繼發(fā)耐藥突變 (secondary drug resistance mutation) 或代償性耐藥突變 (compensatory drug resistance mutation) 在原發(fā)耐藥突變的基礎(chǔ)上，突變病毒株在其他位點(diǎn)發(fā)生突變，使突變的病毒復(fù)制能力部分恢復(fù)并對藥物的敏感性進(jìn)一步降低[26]。
2.3基因型耐藥 (genotypic resistance) 在抗病毒治療過程中，檢測到與乙型肝炎病毒 (HBV) 耐藥相關(guān)的位點(diǎn)突變[26]。
2.4表型耐藥 (phenotypic resistance) 在體外細(xì)胞復(fù)制系統(tǒng)中證實(shí)HBV基因組中1個(gè)或1個(gè)以上位點(diǎn)突變，使病毒對藥物的敏感性降低 (以EC50表示) [26]。
2.5交叉耐藥 (cross resistance) 針對1種抗病毒藥物出現(xiàn)的耐藥突變，導(dǎo)致病毒對另1種或幾種抗病毒藥物的敏感性也下降，甚至出現(xiàn)耐藥[26]。
2.6多藥耐藥 (multidrug resistance) 至少對2種無交叉耐藥譜且是不同類別的NAs耐藥[26]。
2.7原發(fā)無應(yīng)答 (primary non-response) 在依從性良好的情況下，用NAs治療3個(gè)月 (12周) 時(shí)，HBV DNA下降<1 lg IU/ml[4-5]。
2.8部分病毒學(xué)應(yīng)答 (partial virological response) 在依從性良好的情況下，治療至6個(gè)月 (24周) 時(shí)，仍能檢測到HBV DNA，但下降>1 lg IU/ml[4]。判定部分病毒學(xué)應(yīng)答的時(shí)間因NAs類別而異，對于低耐藥基因屏障NAs，如LAM和LdT，判定時(shí)間為6個(gè)月 (24周)，而對于高耐藥基因屏障NAs，如ETV和TDF，判定時(shí)間為12個(gè)月 (48周)[2]。
2.9完全病毒學(xué)應(yīng)答 (complete virological response) 在抗病毒治療時(shí)，用靈敏的實(shí)時(shí)PCR檢測，HBV DNA檢測不到或低于檢測下限[3]。
2.10生化學(xué)應(yīng)答 (biochemical response) 在抗病毒治療時(shí)，基線丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (ALT) ≥2倍正常值上限 (ULN) 患者，ALT降至正常[2]。
2.11病毒學(xué)突破 (virological breakthrough) 在未更改治療的情況下，獲得部分或完全病毒學(xué)應(yīng)答的患者，其HBV DNA水平較治療中最低點(diǎn)上升1 lg IU/ml，并在間隔1個(gè)月以上的第2次檢測證實(shí)[5, 25]。
2.12生化學(xué)突破 (biochemical breakthrough) 在未更改治療的情況下，基線ALT≥2′ULN，且在治療中ALT已降至正常的患者，ALT升至高于ULN[27]。
2.13病毒學(xué)反彈 (virological rebound) 在未更改治療的情況下，獲得部分或完全病毒學(xué)應(yīng)答的患者，其HBV DNA載量超過治療前水平[28]。
2.14肝炎復(fù)燃 (hepatitis flare) 在未更改治療的情況下，獲得生化學(xué)應(yīng)答患者的血清ALT突然上升>5′ULN或>3倍基線ALT水平，并排除其他原因引起ALT升高的可能[29]。
3 核苷和核苷酸類藥物耐藥機(jī)制及影響因素
3.1 耐藥機(jī)制 病毒耐藥是反映病毒為逃逸藥物壓力而發(fā)生的一系列適應(yīng)性突變，最終導(dǎo)致病毒對藥物的敏感性下降[26]。在慢性乙型肝炎患者體內(nèi)，HBV的復(fù)制效率很高，每天可產(chǎn)生1012~1013個(gè)病毒顆粒，較丙型肝炎病毒 (HCV) 和人類免疫缺陷病毒 (HIV) 分別高10倍和100倍，HBV聚合酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，缺乏校正能力，且錯(cuò)配率較高。據(jù)推算，HBV每年發(fā)生氨基酸置換位點(diǎn)為(1.4~3.2)′10-5[30]。HBV復(fù)制的這一特點(diǎn)也決定其在同一患者體內(nèi)的病毒構(gòu)成并不均一，而是由基因序列存在差異的多種病毒株組成，這些序列不同的病毒群稱為準(zhǔn)種 (quasispecies)。目前抗病毒治療的NAs作用靶點(diǎn)均為病毒聚合酶基因，已知與耐藥相關(guān)的突變均位于HBV聚合酶基因的逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū) (RT區(qū))，可分為原發(fā)耐藥突變和繼發(fā)或代償性耐藥突變[25-26]。
根據(jù)藥物分子結(jié)構(gòu)，目前應(yīng)用的NAs可分為L型核苷類 (LAM和LdT)、D型環(huán)戊烷 (烯) 類 (ETV) 和無環(huán)磷酸鹽類 (ADV和TDF)。該3類5種NAs的原發(fā)耐藥突變位點(diǎn)如圖1所示。
 圖1 核苷和核苷酸類藥物常見原發(fā)性耐藥突變位點(diǎn) (改編自參考文獻(xiàn)[2]、[31]和[32])
3.2 影響耐藥的因素 在臨床應(yīng)用中，一種藥物能否選擇出耐藥突變，受病毒、宿主和藥物等多種因素影響[26,32]。
3.2.1病毒因素 包括病毒的復(fù)制速度、病毒復(fù)制的保真性、基線的HBV DNA載量、準(zhǔn)種、預(yù)存耐藥突變、耐藥突變株的適應(yīng)性和復(fù)制空間等[31, 33-35]。如前所述，HBV的高復(fù)制率和較低的復(fù)制保真性等特點(diǎn)，決定其易發(fā)生耐藥突變。此外，耐藥的發(fā)生還與患者基線的病毒載量、準(zhǔn)種的復(fù)雜度有關(guān)。LdT的GLOBE研究結(jié)果提示，基線HBV DNA較低的患者 (HBV DNA < 9 lg拷貝/ml的HBeAg陽性患者和HBV DNA < 7 lg拷貝/ml的HBeAg陰性患者) 2年的耐藥發(fā)生率較低[36]。抗病毒治療中HBV準(zhǔn)種的復(fù)雜度與耐藥病毒株的選擇有一定的相關(guān)性，特別是在抗病毒治療中維持較高HBV準(zhǔn)種復(fù)雜度的患者易發(fā)生耐藥[37-38]。有研究表明，一些慢性乙型肝炎患者在治療前體內(nèi)已有HBV耐藥突變毒株，稱為預(yù)存耐藥[39-40]。對一些NAs經(jīng)治的慢性乙型肝炎患者，在選擇后續(xù)的治療方案前，應(yīng)考慮其體內(nèi)可能存在對經(jīng)治藥物的耐藥突變株。
3.2.2宿主因素 包括既往抗病毒治療史、依從性、機(jī)體免疫和代謝狀況、藥物遺傳學(xué)和宿主的體質(zhì)量等[23-25, 31]。其中患者的依從性對耐藥的發(fā)生尤為重要。據(jù)調(diào)查，40%的耐藥患者與其依從性差有關(guān)[27]。Chotiyaputta等[41]對美國2007、2008和2009年1月接受LAM、ADV、ETV或TDF治療的3個(gè)慢性乙型肝炎患者隊(duì)列進(jìn)行了依從性調(diào)查，隨訪1年結(jié)果表明，新治和已治患者的依從性在95%日以上者僅為39.7%和46.1%。我國慢性乙型肝炎患者對抗病毒治療的依從性更低。據(jù)調(diào)查，患者自行停藥換藥者為47%~49%，其中治療1年內(nèi)自行停藥換藥者占19%~24%[16]。因此，在臨床實(shí)踐中，應(yīng)特別重視對上述依從性差并具有耐藥高風(fēng)險(xiǎn)患者的治療和管理策略。
3.2.3藥物因素 包括藥物的耐藥基因屏障、抗病毒效力、劑量和化學(xué)結(jié)構(gòu)等。藥物的耐藥基因屏障是指為顯著降低抗病毒藥物敏感性所需的位點(diǎn)突變數(shù)目[32]，即出現(xiàn)原發(fā)耐藥所需的位點(diǎn)突變數(shù)目。例如，在每個(gè)復(fù)制周期中，出現(xiàn)1個(gè)特定堿基錯(cuò)配的概率為10-5，同時(shí)出現(xiàn)2個(gè)和3個(gè)堿基錯(cuò)配的概率則分別為10-10和10-15。耐藥基因屏障越高，所需同時(shí)出現(xiàn)的突變位點(diǎn)越多，發(fā)生耐藥的風(fēng)險(xiǎn)也就越低。LAM、LdT和ADV為低耐藥基因屏障藥物，僅需出現(xiàn)1個(gè)原發(fā)耐藥位點(diǎn)突變位點(diǎn)即可導(dǎo)致藥物敏感性下降。ETV是目前耐藥基因屏障最高的藥物之一，需同時(shí)出現(xiàn)3個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變才可導(dǎo)致藥物敏感性下降[42-44]。TDF與ADV存在一定程度的交叉耐藥[44-45]；在HIV和HBV共感染患者中，已發(fā)現(xiàn)TDF基因型耐藥突變 (rtL180M、rtA194T和rtM204V)[46]，但在慢性乙型肝炎患者中尚未發(fā)現(xiàn)耐藥病例，提示其具有較高耐藥基因屏障。
交叉耐藥可降低藥物的耐藥基因屏障。如LAM耐藥患者僅需再出現(xiàn)1個(gè)位點(diǎn)突變即可對ETV耐藥[42-43]，已發(fā)生LAM耐藥患者用ETV單藥治療5年，耐藥發(fā)生率高達(dá)51%[47]。
藥物抑制病毒復(fù)制的能力是防止耐藥發(fā)生的關(guān)鍵因素之一?？共《拘ЯΦ偷乃幬铮溥x擇壓力低，耐藥發(fā)生率相對較低，如ADV。但抗病毒效力較強(qiáng)的藥物，選擇壓力增強(qiáng)，如其耐藥基因屏障低，可較快選擇出耐藥突變毒株，如LAM和LdT。當(dāng)藥物抗病毒效力很強(qiáng)，耐藥基因屏障高，能完全抑制病毒復(fù)制，則選擇壓力較低，因?yàn)闊o病毒復(fù)制就不會(huì)有基因突變。此外，抗病毒效率還與藥物劑量有關(guān)，如TDF與ADV的抗病毒活性相似，但由于TDF的臨床應(yīng)用劑量更大，其抗病毒效力更強(qiáng)。因此，為防止耐藥突變株的發(fā)生，應(yīng)最大限度地迅速抑制病毒復(fù)制，并在后續(xù)治療中保持對病毒的持續(xù)抑制[23]。
4 耐藥突變與S基因突變
由于在HBV基因組中，病毒聚合酶編碼基因與包膜蛋白編碼基因 (S) 的開放讀碼框 (ORF) 存在重疊，S基因完全被聚合酶基因覆蓋，NAs治療誘導(dǎo)的聚合酶編碼基因的耐藥突變，可能使編碼HBV表面抗原 (HBsAg) 的S基因發(fā)生突變，從而導(dǎo)致HBsAg抗原性、結(jié)構(gòu)或病毒適應(yīng)性發(fā)生變化，產(chǎn)生免疫逃逸突變株等[48-51]。
HBV聚合酶基因的耐藥突變，如rtA181T和rtM204I，極少數(shù)可引起S基因的無義突變 (分別對應(yīng)sW172*和sW196*)，在S基因上提前產(chǎn)生1個(gè)終止密碼子，生成截短的S蛋白。體外細(xì)胞和動(dòng)物研究顯示，rtA181T/sW172*突變毒株病毒顆粒分泌異常，使截短的S蛋白在細(xì)胞內(nèi)聚集，并使野生型毒株的分泌顯著下降，導(dǎo)致細(xì)胞外低病毒載量，此時(shí)若僅根據(jù)血清病毒載量來判斷病毒學(xué)突破，往往不能發(fā)現(xiàn)耐藥相關(guān)突變[52]。動(dòng)物試驗(yàn)顯示，截短的S蛋白具有潛在致癌性[52-55]。
臨床研究表明，抗病毒治療慢性乙型肝炎患者可明顯降低肝硬化和HCC的發(fā)生[56]。慢性乙型肝炎患者只要有適應(yīng)證，就應(yīng)進(jìn)行抗病毒治療。但長期抗病毒治療引起的突變，特別是引起前S與S區(qū)突變的潛在致癌性值得進(jìn)一步研究。至今尚無明確的臨床研究證實(shí)抗病毒治療耐藥相關(guān)突變與致癌性有關(guān)。特別是近年關(guān)于rtA181T/ sW172*突變毒株具有潛在致癌性的報(bào)道，多為體外細(xì)胞和動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果；僅在有限的病例中進(jìn)行的回顧性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)突變與較高的HCC發(fā)生有關(guān)，尚需進(jìn)一步開展前瞻性臨床研究證實(shí)。
5 耐藥模式 (通路)
目前主要的耐藥模式 (通路) 有以下5種[5,32]：
5.1 L型核苷耐藥模式 (通路) rt204位點(diǎn)突變。rtM204V/I可引起L型核苷類藥物 (如LAM和LdT)耐藥，進(jìn)一步促進(jìn)D型環(huán)戊烷 (烯) 類藥物 (ETV) 耐藥[42-43, 57]。
5.3 共享 (公共) 耐藥模式 (通路) rt181位點(diǎn)突變。可導(dǎo)致L型核苷類藥物和ADV耐藥，并降低TDF的敏感性；這一模式可見于40% ADV治療失敗和5% LAM治療失敗患者[4-5]。
5.5 ETV初治耐藥模式 rtL180M + rtM204V/I + rtI169、rtT184、rtS202或rtM250任意1個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)突變；3個(gè)突變同時(shí)發(fā)生可導(dǎo)致ETV耐藥[19]。
不同NAs可能有相同的耐藥模式 (通路)，相互之間存在交叉耐藥，見表1。
表1 最常見的HBV耐藥突變株交叉耐藥情況
注：S：敏感；I：中度；R：耐藥。
6 多藥耐藥
在因耐藥挽救治療或因其他原因應(yīng)用多種NAs治療的患者體內(nèi)，可能發(fā)生針對多種NAs的耐藥突變。在用有交叉耐藥藥物序貫治療時(shí)更易發(fā)生耐藥。研究還發(fā)現(xiàn)，即便采用“加藥”策略，如果不能迅速抑制病毒，也可能選擇出多藥耐藥突變[26]。不同的耐藥突變共存于同一病毒株，使該毒株對多種NAs耐藥。Villet等[43]在1例先后接受LAM及LAM聯(lián)合ADV治療的患者體內(nèi)，檢測到同時(shí)攜帶LAM耐藥突變和ADV耐藥突變的聯(lián)合突變病毒株 (rtV173L + L180M+ A181V+N236T)。該病毒株對LAM單藥、ADV單藥和LAM聯(lián)合ADV治療的敏感性均顯著下降，提示多藥耐藥的病毒株對聯(lián)合用藥的治療效果也不佳[26]。我國也報(bào)道有多藥耐藥的病例[58]。
7 耐藥的臨床表現(xiàn)
病毒學(xué)突破是耐藥最早的臨床表現(xiàn)。發(fā)生病毒學(xué)突破后，90%以上的患者可出現(xiàn)生化學(xué)突破。如不及時(shí)挽救治療，可發(fā)生病毒學(xué)反彈和肝炎發(fā)作，也可能出現(xiàn)肝臟功能失代償、急性肝衰竭，甚至死亡[4, 20, 28, 59]。依從性差和/或病毒耐藥是NAs治療時(shí)出現(xiàn)病毒學(xué)突破的主要因素[4,26]。在病毒學(xué)突破前已可檢測到基因型耐藥和表型耐藥。不是所有病毒學(xué)突破均由抗病毒耐藥突變引起，必須進(jìn)行確證[60]。
8 耐藥的評估
8.1 HBV DNA監(jiān)測和隨訪 HBV DNA監(jiān)測對評估治療成敗至關(guān)重要。無論是在基線評估，還是治療應(yīng)答評估，或者是病毒學(xué)突破判斷，均應(yīng)使用靈敏、特異和線性范圍廣的實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測HBV DNA水平，結(jié)果用國際單位 (IU/ml) 表示，國外試劑的1 IU/ml約等于5~6 拷貝/ml，但因試劑盒而異。國內(nèi)試劑間的差異較大。為確保檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和一致性，對于在同一個(gè)地方就診的同一例患者，應(yīng)堅(jiān)持采取同一種檢測方法進(jìn)行評估。
開始NAs治療前，應(yīng)對患者進(jìn)行基線HBV DNA定量檢測，判斷治療適應(yīng)證和預(yù)測療效。在治療期間，應(yīng)至少每3個(gè)月檢測1次HBV DNA。獲得完全病毒學(xué)應(yīng)答后，可隔3~6個(gè)月檢測1次 [4]。
8.2 耐藥位點(diǎn)檢測 耐藥突變一旦被選擇出來，突變病毒準(zhǔn)種會(huì)在患者體內(nèi)長期存在。如在LAM耐藥患者中，停用LAM 4年后，患者體內(nèi)仍能檢測到耐藥突變株。由于NAs在臨床中應(yīng)用較為普遍，用1種以上NAs治療過的患者越來越多。因而，對于因復(fù)發(fā)、耐藥或其他原因再治療的NAs經(jīng)治患者，有條件者應(yīng)進(jìn)行耐藥位點(diǎn)檢測，以確定突變模式 (通路)，進(jìn)行針對性治療，臨床上對既往有某種藥物耐藥史而停藥或改為其他治療的病例，用目前方法即使不能測出耐藥，也應(yīng)該按照耐藥處理。對于原發(fā)無應(yīng)答、部分病毒學(xué)應(yīng)答或病毒學(xué)突破的患者，進(jìn)行耐藥位點(diǎn)檢測則有助于指導(dǎo)治療方案的調(diào)整。
目前我國尚缺乏規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)一的基因型耐藥檢測方法，不同的引物、不同的測序公司、不同的試劑盒，結(jié)果可能不同。因此，基因型耐藥檢測必須標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化，并用統(tǒng)一方法檢測，根據(jù)患者的用藥情況進(jìn)行針對性的基因型耐藥檢測。只有用實(shí)時(shí)定量PCR法能檢測到HBV DNA的患者，才有可能進(jìn)行基因型耐藥檢測。
常用的基因型耐藥檢測方法有：
① PCR產(chǎn)物直接測序法[61]：是最常用的基因型耐藥檢測方法之一，能測出所有突變位點(diǎn)，包括可能的代償突變和新突變位點(diǎn)，對于新的治療手段，或現(xiàn)行治療的新耐藥相關(guān)位點(diǎn)突變，需用體外表型分析法驗(yàn)證。PCR產(chǎn)物直接測序法靈敏度低，最低檢測限為20%，即突變株數(shù)量需達(dá)到整個(gè)病毒群的20%時(shí)，才能檢測到。
② PCR產(chǎn)物克隆測序法[62]：是將PCR產(chǎn)物連接載體后轉(zhuǎn)化至細(xì)菌，選10~30個(gè)陽性克隆進(jìn)行測序，有助于發(fā)現(xiàn)混合株，并可大致確定不同序列毒株之間的相對比例，其靈敏度高于PCR產(chǎn)物直接測序法，但操作相對較復(fù)雜，費(fèi)用較高，也比較費(fèi)時(shí)。
③限制性片段長度多態(tài)性技術(shù) (RFLP)[26]：靈敏，最低檢測限為5%，但必須針對每一個(gè)待測突變位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)特異性內(nèi)切酶反應(yīng)系列，僅適用于已知的耐藥位點(diǎn)。一些突變可生成新的酶切位點(diǎn)，或破壞原酶切位點(diǎn)，此時(shí)必須謹(jǐn)慎看待檢測結(jié)果。
④線性探針反向雜交法 (INNO-LiPA)[63-66]：靈敏，最低檢測限為5%，可檢測單個(gè)核苷酸錯(cuò)配，僅適用于已知的耐藥位點(diǎn)。
9 耐藥管理
9.1 原發(fā)無應(yīng)答和部分病毒學(xué)應(yīng)答的處理
9.1.1原發(fā)無應(yīng)答 無論用哪種NAs治療慢性乙型肝炎，發(fā)生原發(fā)無應(yīng)答時(shí)均應(yīng)檢查患者的依從性[4]。如確認(rèn)依從性良好，可進(jìn)行HBV RT區(qū)測序，以鑒定可能存在的耐藥突變，針對性地早期更換成更有效的藥物。如NAs初治患者，用ADV治療時(shí)出現(xiàn)原發(fā)無應(yīng)答，優(yōu)先推薦改用ETV或TDF，或加用LAM或LdT。用ETV、LAM、LdT治療原發(fā)無應(yīng)答者，可選擇加用ADV，也可換用或加用TDF。需要說明的是，有關(guān)原發(fā)無應(yīng)答的定義仍值得探討，歐洲和美國指南中的描述稍有不同，而且未考慮到不同藥物抗病毒效能的差異，需要更多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)來證實(shí)是否應(yīng)該進(jìn)行個(gè)體化的調(diào)整策略。
9.1.2部分病毒學(xué)應(yīng)答 所有NAs治療時(shí)均可出現(xiàn)部分病毒學(xué)應(yīng)答。同樣，在出現(xiàn)部分病毒學(xué)應(yīng)答時(shí)，首先需檢查患者的依從性[2, 4-5]，隨后根據(jù)藥物的抗病毒療效和耐藥基因屏障，調(diào)整治療方案。
對LAM、LdT治療24周部分應(yīng)答者，可加用ADV，或換用TDF。對ADV治療48周時(shí)出現(xiàn)部分病毒學(xué)應(yīng)答，必須考慮換用更強(qiáng)效的藥物 (優(yōu)先選擇無交叉耐藥者) 或加用另外1個(gè)無交叉耐藥的NAs。值得注意的是，聯(lián)合治療后，如果不能迅速使HBV DNA降到不可測水平以下，發(fā)生耐藥的風(fēng)險(xiǎn)仍然較大。
LAM和LdT治療過程中早期病毒學(xué)指標(biāo)可預(yù)測遠(yuǎn)期療效，特別是24周HBV DNA的水平，可預(yù)測治療2~4年的療效。因此Keeffe等[67]提出關(guān)于NAs治療的“路線圖概念”，根據(jù)治療24周HBV DNA水平優(yōu)化治療方案，以提高遠(yuǎn)期療效，降低耐藥的發(fā)生。由于“路線圖概念”是基于以往幾項(xiàng)研究的回顧性分析結(jié)果提出的，我國專家根據(jù)中國國情，設(shè)計(jì)前瞻性隨機(jī)對照試驗(yàn) (EFFORT研究，NIH注冊號(hào)：NCT00962533)，在國際上首次驗(yàn)證了“路線圖概念”。該研究初步結(jié)果顯示[69]：經(jīng)過76周抗病毒治療后，優(yōu)化治療組的療效顯著優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)治療組 (病毒學(xué)應(yīng)答率為74.0% vs 61.1%，P=0.001；耐藥率為1.4% vs11.4%，P<0.001)。
對于強(qiáng)效、低耐藥的藥物 (如ETV和TDF) ，治療48周時(shí)出現(xiàn)部分病毒學(xué)應(yīng)答的處理方法，目前仍有爭議?？筛鶕?jù)患者的基線HBV DNA水平、治療48周的HBV DNA水平和治療期間的HBV DNA動(dòng)態(tài)變化綜合考慮。如對于基線高病毒載量 (如>2×107 IU/ml)、HBV DNA持續(xù)下降者可繼續(xù)使用原藥，隨治療時(shí)間延長，仍能獲得病毒學(xué)應(yīng)答，且耐藥率很低[5, 20, 69]。而對于依從性良好，但病毒不再持續(xù)下降，達(dá)到平臺(tái)期的患者，應(yīng)迅速調(diào)整治療方案，優(yōu)先考慮加用另外一種藥物 (ETV治療時(shí)加用ADV或TDF)，有利于預(yù)防長期治療中耐藥的發(fā)生。TDF在我國尚未批準(zhǔn)用于治療乙型肝炎，對于ETV治療出現(xiàn)部分病毒學(xué)應(yīng)答的NAs初治患者，可加用ADV。
9.2 耐藥的處理 由于病毒基因型耐藥突變的發(fā)生早于生化學(xué)突破幾個(gè)月，因此，早期發(fā)現(xiàn)耐藥并及時(shí)處理可避免肝炎發(fā)作，這在使用免疫抑制劑治療和肝硬化的患者中尤為重要[26, 31]。在依從性良好的患者中，一旦發(fā)現(xiàn)HBV DNA升高，應(yīng)立即檢查患者的依從性，并在1個(gè)月后復(fù)查HBV DNA，有條件者可進(jìn)行基因型耐藥檢測。當(dāng)檢出基因型耐藥或證實(shí)出現(xiàn)病毒學(xué)突破時(shí)，應(yīng)立刻予以挽救治療，選擇加用無交叉耐藥的抗病毒藥，將多藥耐藥的風(fēng)險(xiǎn)降到最低。此外，NAs耐藥患者亦可考慮加用聚乙二醇干擾素 (Peg IFN) 治療 (但療效不如初治患者)[70]。因安全性原因，LdT不能與Peg IFN聯(lián)合應(yīng)用[71].。
抗病毒耐藥的挽救治療見表2。
表2 抗病毒耐藥挽救治療
值得指出的是：雖然挽救治療可較好抑制耐藥株的復(fù)制，但也有增加多藥耐藥的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在初始治療藥物選擇時(shí)，應(yīng)盡量選擇高效、低耐藥的NAs。
對于用LAM或LdT和ADV治療失敗的患者，懷疑多藥耐藥時(shí)，進(jìn)行基因型耐藥檢測。對多藥耐藥患者，應(yīng)聯(lián)合使用NAs治療，優(yōu)先選擇ETV聯(lián)合TDF。多藥耐藥管理的關(guān)鍵在于預(yù)防，需反復(fù)強(qiáng)調(diào)初治藥物選擇和最大限度地抑制病毒復(fù)制的重要性，避免低耐藥基因屏障藥物的單藥序貫治療，盡量減少或避免多藥耐藥的發(fā)生。
10 耐藥的預(yù)防
耐藥的管理重在預(yù)防，必須強(qiáng)調(diào)和重視耐藥相關(guān)知識(shí)的推廣和教育，強(qiáng)化耐藥的規(guī)范化管理，強(qiáng)調(diào)耐藥檢測和監(jiān)測方法的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化?。
10.1 仔細(xì)了解患者既往治療史 自1998年LAM在我國上市后，至今已有200余萬慢性乙型肝炎患者接受過NAs治療，因此，在應(yīng)用NAs治療前，應(yīng)仔細(xì)了解患者既往NAs治療史 (包括NAs種類、療程、療效和耐藥等)，這對選擇何種NAs藥物治療十分重要。
10.2 初始選用強(qiáng)效、高耐藥基因屏障藥物的單藥長期治療 對既往未接受過NAs治療的患者，應(yīng)選擇強(qiáng)效、高耐藥基因屏障的抗病毒藥物。亞太、歐洲和美國肝病學(xué)會(huì)的慢性乙型肝炎診療共識(shí)或指南均推薦，NAs初治患者應(yīng)選擇強(qiáng)效、高耐藥基因屏障的抗病毒藥物，即ETV和TDF作為優(yōu)選或一線單藥治療[5-6, 72]。我國指南也建議：“如條件允許，初始治療時(shí)宜選用抗病毒作用強(qiáng)和耐藥發(fā)生率低的藥物”[1]。初始選擇高耐藥基因屏障藥物，不僅能降低耐藥的發(fā)生，減少耐藥相關(guān)的并發(fā)癥，同時(shí)毋需在治療前進(jìn)行基因型耐藥檢測，減少治療監(jiān)測的次數(shù)，并降低挽救治療的需求和節(jié)省相關(guān)成本。
目前對于中、低效NAs初始聯(lián)合治療是否優(yōu)于單個(gè)高效低耐藥物治療，尚無充分的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)證實(shí)[73]，且與單藥治療比較，初始聯(lián)合治療是否能增加療效或改善臨床預(yù)后，亦缺乏高級(jí)別的臨床試驗(yàn)證據(jù)。尤其是考慮到近年來高效、低耐藥NAs相繼上市，應(yīng)用ETV和TDF單藥治療即可達(dá)到持續(xù)抑制病毒復(fù)制及耐藥發(fā)生率低的目的。目前初始聯(lián)合治療在歐洲和美國肝病學(xué)會(huì)制訂的慢性乙型肝炎診治指南中，不推薦作為一線治療方案[2, 4, 74-76]。
10.3 加強(qiáng)患者對疾病的認(rèn)識(shí)和依從性教育 盡管病毒學(xué)突破是耐藥的重要表現(xiàn)，但并非所有病毒學(xué)突破均由耐藥導(dǎo)致。Hongthanakorn等[60]隊(duì)列研究表明，高達(dá)40%病毒學(xué)突破可能與耐藥無關(guān)，而是由于患者的依從性差所致。對疾病的認(rèn)知不足是導(dǎo)致依從性不佳的重要原因，對我國慢性乙型肝炎患者的一項(xiàng)認(rèn)知程度調(diào)查顯示，有22%~27%的患者對慢性乙型肝炎的危害性和長期治療的必要性缺乏認(rèn)識(shí)，僅有46.3%的患者認(rèn)識(shí)到抗病毒治療的重要性[77]。另一項(xiàng)調(diào)查顯示，我國LAM經(jīng)治患者中，近半數(shù)患者曾有自行停藥史[16]。
由于NAs治療通常需要長期治療，堅(jiān)持服藥和遵照治療方案對維持病毒的持久抑制非常重要。因此，需要加強(qiáng)對患者教育，治療前應(yīng)就疾病特點(diǎn)、治療目的、治療意義和治療方案向患者進(jìn)行充分的解釋和說明，治療中加強(qiáng)與患者的溝通和隨訪，幫助去除影響患者依從性的不良因素，注意糾正患者的不良用藥習(xí)慣或自行調(diào)整治療方案等。
10.4 避免低耐藥基因屏障藥物的單藥序貫治療 低耐藥基因屏障藥物的單藥序貫治療，可增加發(fā)生多藥耐藥和交叉耐藥的風(fēng)險(xiǎn)，如LAM序貫LdT、LAM序貫ADV、LAM序貫ETV。過去臨床上曾采用換用ADV序貫治療的方法作為LAM耐藥的挽救治療。部分LAM耐藥患者在換用ADV治療后，隨即也對ADV發(fā)生耐藥[3,26, 74]。
10.5 嚴(yán)格掌握治療適應(yīng)證 為降低耐藥風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)嚴(yán)格掌握治療適應(yīng)證，避免不必要的治療[3]。如對于肝臟炎癥病變輕微、難以取得持續(xù)應(yīng)答的患者 (如ALT正常、高病毒載量、HBeAg陽性的免疫耐受期患者)，應(yīng)當(dāng)避免使用NAs治療。
10.6 加強(qiáng)對醫(yī)務(wù)人員抗病毒治療耐藥預(yù)防和管理的教育 我國慢性乙型肝炎患者的NAs治療中，存在很多不規(guī)范治療的情況，包括單藥隨意序貫治療 (多種藥物序貫組合，占70.7%)、短期內(nèi)頻繁換藥或加藥，以及耐藥后不合理加藥或換藥等。這些現(xiàn)象與我國醫(yī)務(wù)人員對耐藥重要性的認(rèn)識(shí)不足有一定關(guān)系。因此，必須強(qiáng)調(diào)耐藥規(guī)范化管理。對臨床醫(yī)師尤其是感染科及消化內(nèi)科醫(yī)師，應(yīng)加強(qiáng)關(guān)于抗病毒耐藥機(jī)制、預(yù)防、管理和救治的繼續(xù)教育，進(jìn)一步提高我國醫(yī)務(wù)人員對抗病毒耐藥的認(rèn)識(shí)。同時(shí)，對患者也應(yīng)加強(qiáng)教育，提升其對抗病毒治療的依從性。
10.7 加強(qiáng)學(xué)術(shù)界、政府部門及醫(yī)藥企業(yè)之間的良性互動(dòng)
在治療慢性乙型肝炎過程中，NAs的正確應(yīng)用不僅僅是一個(gè)科學(xué)問題，也受到社會(huì)經(jīng)濟(jì)水平的影響。雖然我國經(jīng)濟(jì)總量增長迅速，但人均收入水平仍屬發(fā)展中國家，社會(huì)保障體系也有待進(jìn)一步完善。為此，學(xué)術(shù)團(tuán)體或其他非政府組織應(yīng)當(dāng)通過客觀、公正的臨床醫(yī)學(xué)和衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)研究，為政府部門制訂新藥審批、定價(jià)及醫(yī)保支付政策提供可靠的藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)證據(jù)。應(yīng)該建立政府主管部門、醫(yī)療保險(xiǎn)管理機(jī)構(gòu)、制藥企業(yè)及醫(yī)療服務(wù)提供者之間的公平協(xié)商和價(jià)格談判機(jī)制，從而為廣大乙型肝炎患者提供效果可靠、價(jià)格合理、公平可及的優(yōu)質(zhì)醫(yī)療服務(wù)[78]。
總之，在選擇NAs治療時(shí)，臨床醫(yī)生應(yīng)認(rèn)真考慮患者的具體病情、既往用藥史、經(jīng)濟(jì)狀況，以及不同地區(qū)的醫(yī)療保險(xiǎn)制度和經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平，充分與患者溝通，并根據(jù)自己的專業(yè)知識(shí)、臨床經(jīng)驗(yàn)和可利用的醫(yī)療資源，合理選擇抗病毒治療藥物，規(guī)范治療，并在治療過程中及時(shí)監(jiān)測，一旦發(fā)現(xiàn)原發(fā)無應(yīng)答、部分應(yīng)答或耐藥突變，應(yīng)迅速調(diào)整治療。
參與討論的專家（按姓氏拼音排序）：
陳成偉、陳從新、陳士俊、陳永平、成 軍、程明亮、竇曉光、
段鐘平、高志良、侯金林、賈繼東、江家驥、李 杰、李蘭娟、
李 彤、魯鳳民、茅益民、繆曉輝、寧 琴、?？∑?、任 紅、
斯崇文、孫永濤、譚德明、唐 紅、唐小平、萬謨彬、王德?lián)P、
王貴強(qiáng)、王 豪、王慧芬、王宇明、魏 來、翁心華、謝 青、
楊益大、尤 紅、張玲霞、張文宏、張欣欣、莊 輝。
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