摘要：《培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的動態(tài)變化》是新課標(biāo)教材“必修3：穩(wěn)態(tài)與環(huán)境”中的學(xué)生分組實驗，該實驗需要測定酵母菌細(xì)胞數(shù)量，教材采用顯微鏡直接計數(shù)法，需要學(xué)生學(xué)會使用血球計數(shù)板進(jìn)行準(zhǔn)確計數(shù)。但是該計數(shù)方法，對高中教師來說，比較陌生，對學(xué)生而言，使用的難度較大。本文通過結(jié)合《培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的動態(tài)變化》這一實驗，對血球計數(shù)板的使用原理和操作步驟、方法等進(jìn)行詳細(xì)地介紹，并分析有關(guān)血球計數(shù)板的命題。

關(guān)鍵詞：血球計數(shù)板  使用原理、方法  問題討論

《培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的動態(tài)變化》是新課標(biāo)教材“必修3：穩(wěn)態(tài)與環(huán)境”中的學(xué)生分組實驗，該實驗通過探究培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的變化，嘗試建構(gòu)種群增長的數(shù)學(xué)模型并用數(shù)學(xué)模型解釋種群數(shù)量的變化，說明制約種群個體數(shù)量變化的種群外部環(huán)境因素和種群內(nèi)部因素。

在該實驗中，需要測定酵母菌細(xì)胞數(shù)量。測定細(xì)胞數(shù)目的方法有顯微鏡直接計數(shù)法、平板菌落計數(shù)法、光電比濁法等，教材采用的是較為簡便、快速、直觀的顯微鏡直接計數(shù)法。因此，學(xué)會使用血球計數(shù)板進(jìn)行準(zhǔn)確計數(shù)，是該實驗成功與否的關(guān)鍵。

雖然不同版本的教材推薦使用的血球計數(shù)板的規(guī)格不同，人教版建議使用2mm×2mm× 0.1mm方格，蘇教版推薦使用1mm×1mm×0.1mm方格，但是血球計數(shù)板的使用原理和方法是相同的。筆者通過近年來對該實驗的摸索，對血球計數(shù)板的使用和命題方面存在的一些問題進(jìn)行了分析總結(jié)。

一、血球計數(shù)板的使用原理

顯微鏡直接計數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上（又稱計菌器），于顯微鏡下直接計數(shù)，然后推算出含菌數(shù)的一種方法。血球計數(shù)板是常用的計菌器之一。

血球計數(shù)板是一種專門用于計算較大單細(xì)胞微生物的一種儀器，由一塊比普通載玻片厚的特制玻片制成的玻片中有四條下凹的槽，構(gòu)成三個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽隔為兩半，每半邊上面刻有一個方格網(wǎng)。方格網(wǎng)上刻有9個大方格，其中只有中間的一個大方格為計數(shù)室。這一大方格的長和寬各為1mm，深度為0.1mm，其容積為0.1mm³，即1mm×1mm×0.1mm方格的計數(shù)板；大方格的長和寬各2mm，深度為0.1mm，其容積為0.4mm³，即2mm×2mm×0.1mm方格的計數(shù)板。在血球計數(shù)板上，刻有一些符號和數(shù)字(見圖一)，其含義是：XB-K-25為計數(shù)板的型號和規(guī)格，表示此計數(shù)板分25個中格；0.1mm為蓋上蓋玻片后計數(shù)室的高；1/400mm²表示計數(shù)室面積是1mm²，分400個小格，每小格面積是1/400 mm²。

計數(shù)室通常也有兩種規(guī)格：一種是16×25型，即大方格內(nèi)分為16中格，每一中格又分為25小格；另一種是25×16型，即大方格內(nèi)分為25中格，每一中格又分為16小格。但是不管計數(shù)室是哪一種構(gòu)造，它們都有一個共同的特點，即每一大方格都是由16×25=25×16=400個小方格組成。

1．16×25型的計數(shù)板  將計數(shù)室放大，可見它含16中格，一般取四角：1、4、13、16四個中方格（100個小方格）計數(shù)（見圖二）。將每一中格放大，可見25個小格。計數(shù)重復(fù)3次，取其平均值。計數(shù)完畢后，依下列公式計算：

酵母細(xì)胞個數(shù)／1mL=100個小方格細(xì)胞總數(shù)/ 100 ×400×10000×稀釋倍數(shù)

2．25×16型的計數(shù)板  中央大方格以雙線等分成25個中方格，每個中方格又分成16個小方格，供細(xì)胞計數(shù)用（見圖三）。一般計數(shù)四個角和中央的五個中方格（80個小方格）的細(xì)胞數(shù)。計數(shù)重復(fù)3次，取其平均值。計數(shù)完畢后，依下列公式計算：

酵母細(xì)胞個數(shù)／1mL ＝80個小方格細(xì)胞總數(shù)/ 80 ×400×10000×稀釋倍數(shù)

                              c                                 d

血球計數(shù)板的構(gòu)造（三）（25×16）

a．頂面觀  b．側(cè)面觀  c．放大后的網(wǎng)格  d．放大后的計數(shù)室

二、血球計數(shù)板的使用方法步驟

使用血球計數(shù)板計數(shù)時，按照如下的實驗步驟進(jìn)行：

1．鏡檢計數(shù)室。在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計數(shù)；

2．加樣品。將清潔干燥的血球計數(shù)板的計數(shù)室上加蓋專用的蓋玻片，用吸管吸取稀釋后的酵母菌懸液，滴于蓋玻片邊緣，讓培養(yǎng)液自行緩緩滲入，一次性充滿計數(shù)室，防止產(chǎn)生氣泡，充入細(xì)胞懸液的量以不超過計數(shù)室臺面與蓋玻片之間的矩形邊緣為宜。多余培養(yǎng)液可用濾紙吸去；

3．計數(shù)。稍待片刻（約5min），待酵母菌細(xì)胞全部沉降到計數(shù)室底部后，將計數(shù)板放在載物臺的中央，先在低倍鏡下找到計數(shù)室所在位置后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察、計數(shù)并記錄。

三、血球計數(shù)板的使用注意事項

《培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的動態(tài)變化》實驗是一個歷時較長（7天左右）的實驗，事前一定要做好周密的計劃，定程序、定時間、定人員。每天采用抽樣檢測法使用血球計數(shù)板對酵母菌進(jìn)行計數(shù)，在計數(shù)時應(yīng)從以下幾方面注意。

1．每天同一時間，各組取出本組的試管，用血球計數(shù)板計數(shù)酵母菌個數(shù)，并作記錄，連續(xù)觀察7天。

2．從試管中吸出培養(yǎng)液進(jìn)行計數(shù)之前，要將試管輕輕震蕩幾下，這樣使酵母菌分布均勻，防止酵母凝聚沉淀，提高計數(shù)的代表性和準(zhǔn)確性，求得的培養(yǎng)液中的酵母菌數(shù)量誤差小。

3．如果一個小方格內(nèi)酵母菌過多，難以數(shù)清，應(yīng)當(dāng)對培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋以便于酵母菌的計數(shù)。具體方法是：搖勻試管，取1mL酵母菌培養(yǎng)液，加入成倍的無菌水稀釋，稀釋n倍后，再用血球計數(shù)板計數(shù)，所得數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)。以每小方格內(nèi)含有4—5個酵母細(xì)胞為宜。特別是在培養(yǎng)后期的樣液需要稀釋后計數(shù)。

4．活酵母有芽殖現(xiàn)象，若芽體達(dá)到母細(xì)胞大小的一半時，即可作為兩個菌體計數(shù)，若芽體小于母細(xì)胞一半時為1個酵母細(xì)胞。

5．對于壓在方格界線上的酵母菌應(yīng)當(dāng)計數(shù)同側(cè)相鄰兩邊上的菌體數(shù)，一般可采取“數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線”的原則處理，另兩邊不計數(shù)。計數(shù)時，如果使用16格×25格規(guī)格的計數(shù)室，要按對角線位，取左上、右上、左下、右下4個中格(即100個小格)的酵母菌數(shù)；如果規(guī)格為25格×16格的計數(shù)板，除了取其4個對角方位外，還需再數(shù)中央的一個中格(即80個小方格)的酵母菌數(shù)。

6．計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的平均數(shù)值來計算，對每個樣品可計數(shù)三次，再取其平均值。計數(shù)時應(yīng)不時調(diào)節(jié)焦距，才能觀察到不同深度的菌體。按公式計算每1ml（或10mL）菌液中所含的酵母菌個數(shù)。

7．血球計數(shù)板的清潔

血球計數(shù)板使用后，用自來水沖洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，或用95%的乙醇、無水乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑脫水使其干燥。通過鏡檢觀察每小格內(nèi)是否殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)清洗直到干凈為止。

四、關(guān)于血球計數(shù)板的命題

由于實驗《培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的動態(tài)變化》是新教材新增加的實驗，在各地各類命題中都關(guān)注了這一實驗，并對血球計數(shù)板的使用進(jìn)行了命題設(shè)計。從近年來的各類試題來看，試題考查的角度不同，大多數(shù)是關(guān)于細(xì)胞數(shù)量的計算，也有關(guān)于使用原理和方法的考查，但有的試題明顯與血球計數(shù)板的實際使用不相符合。

例1 在用血球計數(shù)板（2mm×2mm方格）對某一稀釋50倍樣品進(jìn)行計數(shù)時，發(fā)現(xiàn)在一個方格內(nèi)（蓋玻片下的培養(yǎng)液厚度為0.1mm）酵母菌平均數(shù)為16，據(jù)此估算10mL培養(yǎng)液中有酵母菌   ▲   個。

（參考答案： 2×10⁷）

解析一：例1將整個計數(shù)室2mm×2mm方格作為實驗計數(shù)的空間，并按照公式：a/4×10⁵（×稀釋倍數(shù)）來計算10mL培養(yǎng)液中的酵母菌的數(shù)量（a為所計數(shù)酵母菌的平均數(shù)）。與血球計數(shù)板的實際操作不相符，存在有科學(xué)性錯誤。

例2 通常用血球計數(shù)板對培養(yǎng)液中酵母菌進(jìn)行計數(shù)，若計數(shù)室為1mm×1mm×0.1mm方格，由400個小方格組成，如果一個小方格內(nèi)酵母菌過多，難以計數(shù)，應(yīng)先   ▲   后再計數(shù)。若多次重復(fù)計數(shù)后，算得每個小方格中平均有5個酵母菌，則10mL該培養(yǎng)液中酵母菌總數(shù)有   ▲   個。

（參考答案：稀釋；2×10⁸）

解析二：例2設(shè)計了血球計數(shù)板的規(guī)格，還考查了血球計數(shù)板的使用方法，較例1更科學(xué)合理。根據(jù)公式：5×400×10000×10＝2×10⁸ 。

例3  檢測員將1 mL水樣稀釋10倍后，用抽樣檢測的方法檢測每毫升藍(lán)藻的數(shù)量；將蓋玻片放在計數(shù)室上，用吸管吸取少許培養(yǎng)液使其自行滲入計數(shù)室，并用濾紙吸去多余液體。已知每個計數(shù)室由25×16＝400個小格組成，容納液體的總體積為0．1 mm³。

現(xiàn)觀察到圖中該計數(shù)室所示a、b、c、d、e 5個中格80個小格內(nèi)共有藍(lán)藻n個，則上述水樣中約有藍(lán)藻  ▲個／mL。

（參考答案：5n×10⁵  ）

解析三：從例3來看，是按照血球計數(shù)板的原理進(jìn)行設(shè)計試題的，還添加了相應(yīng)的圖示，題意一目了然。按照前面所述的公式，不難得出正確答案：酵母細(xì)胞個數(shù)／1mL＝80個小方格細(xì)胞總數(shù)/ 80 ×400×10000×稀釋倍數(shù)＝n/ 80×400×10000×10＝5n×10⁵ 。

例4（2008江蘇高考31．）（4）在整個實驗過程中，直接從靜置的培養(yǎng)瓶中取培養(yǎng)原液計數(shù)的做法是錯誤的，正確的方法是   ▲ 和   ▲   。

（5）實驗結(jié)束后，用試管刷蘸洗滌劑擦洗血球計數(shù)板的做法是錯誤的，正確的方法是   ▲   。

（參考答案（4）搖勻培養(yǎng)液后再取樣  培養(yǎng)后期的樣液稀釋后再計數(shù)（5）浸泡和沖洗）

解析四：例4為2008年江蘇省高考試題第31題的第（4）、（5）兩小問。試題的設(shè)計從血球計數(shù)板的實驗方法入手，需要對實驗操作的正誤進(jìn)行判斷，比起以前關(guān)于數(shù)量的計算的試題，更增強(qiáng)了操作性。實際上，對血球計數(shù)板的使用，不少學(xué)校并沒有真正做，而是教師講解，學(xué)生死記硬背，造成學(xué)生只知其一，不知其二，這也是導(dǎo)致學(xué)生答題失分的主要原因。

綜上所述，通過對血球計數(shù)板的使用和復(fù)習(xí)答題，我真切體會到，要認(rèn)真對待新課程中的每一個實驗?！墩n程標(biāo)準(zhǔn)》倡導(dǎo)探究性學(xué)習(xí)，力圖促進(jìn)學(xué)生學(xué)習(xí)方式的變革，引導(dǎo)學(xué)生主動參與探究過程、勤于動手和動腦，著重培養(yǎng)創(chuàng)新精神和實踐能力。要發(fā)展學(xué)生的科學(xué)探究能力，對生物學(xué)實驗的操作就顯得尤其必要。

所以我們要轉(zhuǎn)變觀念，讓學(xué)生真正做實驗，而不是背實驗。讓學(xué)生在做中領(lǐng)悟?qū)嶒灥脑?，在做中體驗實驗的方法，在做中感受實驗的得失，在做中發(fā)展探究的能力，這樣才能真正提高學(xué)生的科學(xué)素養(yǎng)。

參考文獻(xiàn)

[1]沈萍等.《微生物學(xué)實驗》（第三版）. 高等教育出版社2004年2月

[2]教育部教學(xué)儀器研究所等.《高中生物新課程探究實驗指導(dǎo)》.人民教育出版社2007年2月第1版

（本文發(fā)表于《教學(xué)儀器與實驗》2009.04）