1 概述

     影響化療效果的一個重要問題是發(fā)生了對細胞毒藥物的耐藥性。耐藥性的產(chǎn)生機制，尤其是多藥耐藥性問題是目前研究的一個重點。

根據(jù)腫瘤細胞的耐藥特點,耐藥可分為原藥耐藥(PDR)和多藥耐藥（MDR）兩大類，原藥耐藥(PDR)是指對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生抗藥性后，對非同類型藥物仍敏感；多藥耐藥性（multiple drug resistance，MDR）是指一些癌細胞對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性，同時對其他非同類藥物也產(chǎn)生抗藥性，是造成腫瘤化學藥物治療（化療）失敗的主要原因。 

     多藥耐藥可進一步分為內(nèi)在性多藥耐藥(intrinsicMDR，也有譯成天然性多藥耐藥)和獲得性多藥耐藥(acquired MDR)。內(nèi)在性多藥耐藥(intrinsicMDR)的腫瘤,一開始對抗腫瘤藥物就具有抗藥性。包括消化器官、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤引起的約占61％；屬獲得性多藥耐藥(acquired MDR)的腫瘤,包括皮膚癌、乳腺癌、生殖器癌、內(nèi)分泌腫瘤、白血病和淋巴瘤,約占33％。

     許多天然來源的抗腫瘤藥物如生物堿類抗癌藥物(秋水仙堿、長春堿、三尖杉酯堿和酯杉醇等),蒽環(huán)類抗癌抗生素(阿霉素和柔紅霉素),表鬼臼毒素類(Vp-16和VM-26)及合成藥(米托蒽醌和胺苯丫啶)都極易發(fā)生MDR。新發(fā)現(xiàn)的藥物如紫杉醇和治療慢性粒性白血病的STI-571,都是剛用于臨床就發(fā)現(xiàn)有耐藥性,這使問題更加嚴重。

     2 耐藥發(fā)生的機制 

     2.1 DNA修復能力的增強與耐藥的關(guān)系 

     DNA是傳統(tǒng)的化療藥品烷化劑和鉑類化合物的作用靶點，這些藥物的細胞毒性與DNA損傷有關(guān)。DNA損傷的一個修復機制是切除修復，切除修復需核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶等的參與?；熕幹率笵NA損傷，當二氫葉酸還原酶(DHFR)和DNA損傷修復相關(guān)酶活性增強（MGMT）可增加其對化療藥的耐藥程度。

     阿非迪霉素（aphidicolin）是DNA多聚酶α和γ亞基的抑制劑

     2.2 P-糖蛋白與多藥耐藥

     目前研究最多的是多藥耐藥，與多藥耐藥有關(guān)的分子是P-糖蛋白。1976年，Juliano等首先在耐藥有中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中發(fā)現(xiàn)一種分子量約為1.7×105的膜糖蛋白，在敏感細胞中卻不存在。以后，研究者陸續(xù)在不同來源的多藥耐藥細胞中發(fā)現(xiàn)這種糖蛋白，其分子量在1.3×105~1.8×105之間，主要集中在1.5×105~1.8×105之間。并發(fā)現(xiàn)該糖蛋的表達和細胞膜的通透性、細胞內(nèi)藥物濃度以及細胞耐藥程度有關(guān)。定位于7號染色體的q21.1帶上的MDR1基因。完整的P-gp分子共有12個跨膜疏水區(qū)和2個ATP結(jié)合位點，在膜內(nèi)以二聚體或四聚體方式存在。P糖蛋白是一種能量依賴性藥物排出泵，也就是說它可以與一些抗腫瘤藥物結(jié)合，也有ATP結(jié)合位點。P-糖蛋白一旦與抗腫瘤藥物結(jié)合，通過ATP提供能量，就可將藥物從細胞內(nèi)泵出細胞外，使藥物在細胞內(nèi)濃度不斷下降，并使其細胞毒作用減弱直至散失，出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。P-gp在正常膽管、腎、小腸、腎上腺、造血干細胞等均有表達，負責激素運輸及排泌毒物等生理功能。P-gp高表達的腫瘤病人常伴預后不良，如低緩解率、高復發(fā)率、生存期短，可作為預后評價指標。

     鈣拮抗劑（或鈣調(diào)蛋白拮抗劑）如維拉帕米、異博定、尼卡地平可使耐藥細胞部分恢復對化療藥物的敏感性，其中以維拉帕米的作用最明顯。維拉帕米對耐藥細胞的作用不是通過調(diào)節(jié)鈣濃度，而是與抗癌藥物競爭P-糖蛋白的結(jié)合位點。但是鈣拮抗劑在逆轉(zhuǎn)耐藥的劑量下還具有一些副作用，使這類藥物臨床應用受到限制。

     鈣調(diào)蛋白（CAM）抑制劑：改變膜電位，使耐藥細胞膜電位恢復至敏感細胞水平，從而恢復其敏感性。如鈣調(diào)蛋白拮抗劑三氟拉嗪的作用。

     親脂性化合物：環(huán)孢菌素類（環(huán)孢菌素A及其衍生物SDZPSC833）。

     激素及抗激素類化合物：（TAM）及抗孕激素藥RU486 ，孕酮、甲地孕酮。

     2.3 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）與腫瘤耐藥性

     GSTs是一種廣泛分布的二聚酶，它可以單獨或與谷胱甘肽一起參與許多環(huán)境毒素的代謝、解毒。根據(jù)其在細胞內(nèi)定位的不同，一般可分為α、μ、π、θ及膜結(jié)合微粒體5種類型 。GST-π又稱酸性同工酶，是從胎盤中分離出來的一種酸性GST，其基因定位于11號染色體的q13位置。有7個外顯子和6個內(nèi)含子，全長3kb。它與惡性腫瘤關(guān)系最密切，約占其總數(shù)的90％，主要分布于消化道、泌尿系統(tǒng)和呼吸道上皮。GSH是一種含半胱氨酸的三肽，為細胞內(nèi)主要的非蛋白巰基。GSTs能夠催化機體內(nèi)親電性化合物與GSH結(jié)合，使有毒化合物增加水溶性、減少毒性，最終排出細胞外。這種結(jié)合還可防止有毒化合物與細胞的大分子物質(zhì)（如DNA、RNA和蛋白質(zhì)）結(jié)合。正常情況下可作為一種保護機制使細胞免受損害，而腫瘤細胞可以通過調(diào)節(jié)GSH水平、增加GST活性等加速化學藥物的代謝。

     針對谷胱甘肽和GST的逆轉(zhuǎn)劑：目前抑制GSH的藥物有丁硫氨酸亞砜胺（buthionine sulfoximine ,BSO）、硝基咪唑類、VitK3、撲熱息痛、硒酸鈉、硒半胱氨酸、GS-EA等。BSO是一種人工合成的氨基酸，它是GSH合成限速酶－γ谷氨酰-半胱氨酸合成酶的強效抑制劑，能有效地阻斷GSH的合成，從而降低細胞內(nèi)GSH水平，并增加腫瘤細胞對Mit、DDP和MMC的敏感性。利尿酸，其可逆轉(zhuǎn)烷化劑的耐藥，且有實驗證實與BSO聯(lián)用時逆轉(zhuǎn)作用更大。此外，還有依他尼酸(ethacrynic acid)等。

     2.4 拓撲異構(gòu)酶Ⅱ

     拓撲異構(gòu)酶是DNA復制時必需的酶，它在染色體解旋時催化DNA斷裂和重新連接，拓撲異構(gòu)酶是許多DNA插入和非插入藥物作用的靶點，拓撲異構(gòu)酶Ⅱ在數(shù)量和功能上的改變可能是產(chǎn)生細胞耐藥的機制。

     2.5 蛋白激酶C(PKC)

     PKC是一組Ca2+/磷脂依賴的同工酶，由兩個不同的功能部位組成，即與磷脂、甘油二酯結(jié)合的疏水性調(diào)節(jié)部位，以及含有ATP的底物蛋白結(jié)合區(qū)域，后者是親水性催化部位。PKC有12種類型，各亞型具有不同的組織表達和特定的細胞定位，其中，PKCα和PKCθ與腫瘤多藥耐藥的關(guān)系最為密切。PKC在機體細胞增值、分化和凋亡信號傳導調(diào)控方面發(fā)揮重要作用，同時在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及對抗瘤因子的反應方面也扮演著重要角色。PKC參與蛋白質(zhì)的磷酸化過程，而p-gp是一種磷酸化蛋白，MDR細胞中PKC活性增高，說明兩者存在一定的聯(lián)系。

     根據(jù)作用于PKC的部位，其抑制劑可分為3類：①作用于催化區(qū)；②作用于調(diào)節(jié)區(qū)；③對以上兩區(qū)均有作用。目前已證實的逆轉(zhuǎn)劑有Staurosporine及其衍生物NA-382、CGP41251;此外還有K-252a、calphostinC、H-7等藥物。

     2.6 多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP

     MRP屬ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族成員，MRP基因定位于16號染色體p13.1帶上，由6500bp組成，編碼1531個氨基酸的跨膜糖蛋白，分子量為190kD。耐藥的發(fā)生與依賴ATP的谷胱甘肽S結(jié)合載體（glutathione-S-conjugate carrier）活性提高的緣故，谷胱甘肽S結(jié)合的輸出載體又稱為"GS-X泵"，它可將陰離子的共軛物排泄出細胞，并在清除外源性毒素中發(fā)揮作用。MRP能介導藥物中的谷胱甘肽硫共軛物、葡萄糖醛酸甙共軛物和硫酸鹽共軛物排出細胞。MRP轉(zhuǎn)運的步驟可能為：GSH合成→GSH與藥物偶和→MRP將藥物泵出細胞外。MRP不但定位于血漿細胞膜，而且存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基濾泡處，提示MRP還可在細胞內(nèi)隔離藥物，使藥物不能與靶位點結(jié)合，從而間接導致耐藥。

     喹啉類、抗激素類（如抗孕激素RU486）、非甾體抗炎藥（NASID）、SN-38、GST耗竭劑都能逆轉(zhuǎn)MRP介導的MDR。

    2.7 肺耐藥蛋白（LRP）

     是1993年由Scheper等在1株無p-gp表達的對多種藥物耐藥的非小細胞肺癌細胞系SW-1573中最先發(fā)現(xiàn)的與多藥耐藥有關(guān)的蛋白稱LRP。LRP基因定位于16號染色體，LRP的cDNA全長2688bp,編碼896個氨基酸，分子量為110kD，主要位于胞漿，呈粗顆粒狀或囊泡狀。MVP可通過兩種途徑引起MDR:一是封鎖核孔,使藥物不能進入細胞核,二是使進入細胞內(nèi)的藥物轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)中的運輸囊泡,呈房室分布,最終經(jīng)胞吐機制排出。

     2.8 乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）

     BCRP定位于染色體4q22，含有一個開放讀框（ORF），編碼一個633氨基酸的蛋白，至少與50個ATP結(jié)合盒(adenosine triphosphate -binding cassette,ABC)膜轉(zhuǎn)運蛋白具有同源性。BCRP結(jié)構(gòu)的最主要特點是只有一個ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個疏水性的跨膜結(jié)構(gòu)域,這與典型的ABC轉(zhuǎn)運蛋白明顯不同,后者往往由兩個同源部分組成,每個部分含有一個ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個疏水性的跨膜結(jié)構(gòu)域。因此,稱BCRP為半轉(zhuǎn)運蛋白,推測可能本身或與其它轉(zhuǎn)運分子形成二聚體或多聚體而發(fā)揮作用。

     2.9 細胞凋亡與耐藥

     p53、bcl-2和c-myc發(fā)生缺失、突變等導致表達異常（突變型）時，對凋亡過程調(diào)控異常，可抑制化療藥物誘導的凋亡，導致耐藥，同時也可特異性激活MRP-1／P-gp，產(chǎn)生MDR。c-myc基因很可能參與了mdr1基因的調(diào)控。半胱氨酸蛋白水解酶和耐藥：天門冬氨酸半胱氨酸特異性蛋白酶家族即caspase家族，亦稱ICE/CED-3家族，是一組與細胞凋亡有關(guān)的蛋白酶，也參與MDR。Topo I和Topo II可作為caspase 3和6作用底物?；熕幬镆鸺毎蛲鼍毤せ頲aspase。

     加入促凋亡物質(zhì)如全反式維甲酸等可降低耐藥細胞BCL-2、BCL-XL等基因的表達。植入促凋亡基因，如野生型p-53基因等。

     2.10 其它

     細胞膜的改變影響藥物的轉(zhuǎn)運和外排；細胞激素受體量和親和力的改變；一些細胞因子(如IL-6 )等也與腫瘤細胞耐藥的發(fā)生相關(guān)。

     3 利用生物技術(shù)逆轉(zhuǎn)耐藥

     3.1 給藥載體介導系統(tǒng)在耐藥逆轉(zhuǎn)中的應用 

     逆轉(zhuǎn)劑的應用無疑是解決MDR的一種常用方法，但往往因為逆轉(zhuǎn)劑的毒性較強，副作用較大而影響其在臨床上的廣泛引用。因此，借助某些給藥介導載體，減少藥物用量，實現(xiàn)藥物的靶向給藥將是頗有意義的新途徑。包括：①多肽、蛋白類介導載體；②脂質(zhì)體（liposome）介導；③豪微粒(nanoparticles,NP)介導。

     3.2 反義寡核苷酸技術(shù)（ASONs）

     就是用一段人工合成的能與RNA或DNA互補結(jié)合的寡核苷酸鏈來抑制基因的表達，其作用原理是：①ASONs與DNA結(jié)合，抑制DNA復制和轉(zhuǎn)錄；②ASONs與mRNA前體結(jié)合，阻斷RNA加工、成熟，影響核糖體沿mRNA移動；③激活RNase剪切雜交鏈中未配對的堿基。最近有學者用MRP和bcl-2反義寡核苷酸共轉(zhuǎn)染耐順鉑肺腺癌細胞株（A549／DDP），使該細胞對順鉑敏感性增加4.8－7.2倍。同時對VP-16和表阿霉素敏感性也同步增加。雜合子丟失（Loss of heterozygosity，LOH）可引起必需基因的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms,SNPs）,抑瘤基因P53附近的核糖核酸聚合酶II（POLR2A）基因經(jīng)常在腫瘤細胞顯示雜合性丟失。Kees Fluiter等的報道顯示，直接作用于POLR2A的反義寡核苷酸能抑制體內(nèi)腫瘤細胞生長，并且一個堿基的錯配就能有效地抑制腫瘤生長的特定等位基因。

    3.3 反義RNA技術(shù)

     反義RNA技術(shù)指利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建人工表達載體，使其體外或體內(nèi)表達反義RNA，從而抑制靶基因的表達。其作用原理有：①與前mRNA結(jié)合，影響mRNA的成熟和在胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)運；②與相應的靶RNA結(jié)合從而激活RNase,加速靶RNA的降解；③直接與起始密碼子AUG結(jié)合而阻止轉(zhuǎn)錄的啟動；④互補作用于SD編碼區(qū)的反義RNA可阻止核糖體在mRNA上的移動。Gao等分別把攜有MDR1、MRP反義RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒導入阿霉素選擇出的人NSCLC細胞株GAOK，細胞對阿霉素、長春花堿、秋水仙堿的耐藥程度減少40％-50%，而共轉(zhuǎn)染MDR1和MRP反義RNA后發(fā)現(xiàn)，p-gp、MRP的表達分別減少64％和93％，對上述化療耐藥程度減少97％左右。實驗提示p-gp、MRP在GAOK細胞株耐藥過程中共同起作用，共轉(zhuǎn)染兩者的反義RNA可協(xié)同逆轉(zhuǎn)耐藥。

     3.4 核酶技術(shù)

     核酶是一類具有酶活性的RNA分子，由Cech等首次發(fā)現(xiàn)，它能特異性地識別mRNA中的GUC序列，并催化RNA的剪接和剪切反應，這種作用無需能量就能使RNA被降解，使之無法進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，而且催化效率很高，一分子核酶可切割多分子的靶RNA，自身不被消耗可重復使用。核酶的基因組成分兩部分：中間的極為保守的核苷酸序列（活性中心）和兩端的引導序列。引導序列與靶RNA互補結(jié)合時，中間保守序列即在該特定位點切斷，從而具有高度特異性。另外，核酶不編碼蛋白質(zhì)，無免疫原性。由于其高效率、高特異性、少副作用的特點，核酶在基因治療中倍受青睞，被譽為"分子剪刀"和"分子外科"，在抗HIV、抗病毒和治療白血病及腫瘤方面得到了廣泛的應用。Chen等用mdr1核酶導入A549／R對mdr1 mRNA進行剪切，觀察到mdr1 mRNA減少，p-gp表達下降，細胞對阿霉素敏感性增加200倍。GAO 等用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的MDR1核酶來抑制p-gp在耐藥的腫瘤細胞系GAOK／DOX的表達。Kobayashi用MDR1核酶來逆轉(zhuǎn)急性淋巴細胞白血病細胞的耐藥性，結(jié)果藥物敏感性增加了700倍。值得指出的是，逆轉(zhuǎn)錄病毒由于其可產(chǎn)生高效價病毒，具有高感染效率，可感染許多種細胞，且對宿主細胞無害而在基因逆轉(zhuǎn)方面具有潛在優(yōu)勢。目前，反義核酸藥物的開發(fā)也是最有前景的項目之一，但事實上仍有許多問題待解決：①寡聚物易被降解（經(jīng)過化學修飾的類似物也可在體內(nèi)緩慢清除）；②細胞攝取的效率有待提高；③寡聚物的非特異結(jié)合降低了其效率；④對mRNA的非特異阻斷（可能由于寡聚物同DNA序列能形成部分或暫時的堿基配對）。

     3.6 細胞因子基因

     Stein等研究發(fā)現(xiàn)一些細胞因子如TNF、IFN和IL-2可降低MDR1基因mRNA和p-gp的表達水平，增加細胞對藥物的敏感性。但細胞因子靜脈應用副作用極大，因此他們將細胞因子基因轉(zhuǎn)入腫瘤細胞，結(jié)果顯示可明顯降低MDR1 mRNA 和p-gp的表達水平，使細胞內(nèi)藥物濃度提高。AKI等在研究肝細胞癌細胞系（HepG2,HuH7，SK-Hep-1）時發(fā)現(xiàn),IFN-α和順鉑（CDDP）聯(lián)用時，可降低MDR1、MRP、TOPO IIα和TOPO IIβ基因在HepG2中的表達；降低MDR1和GST-π基因在SK-Hep-1中的表達,從而可增加耐藥細胞系對順鉑（CDDP）的敏感性。這提示我們，聯(lián)合應用CDDP和IFN-α來治療進展期肝癌可能具有一定的臨床價值。

     3.7 間接對抗MDR的基因治療

     將一些耐藥基因（如MDR1、MRP等）轉(zhuǎn)移至造血干細胞，以降低化療藥物對骨髓的毒性，這樣就可能用高劑量的藥物殺傷腫瘤細胞而不破壞骨髓細胞，間接解決耐藥的問題。體外實驗表明,將MDR1基因轉(zhuǎn)移至小鼠的正常骨髓細胞,可提高化療劑量而不增加骨髓毒性.根據(jù)前臨床研究結(jié)果，荷蘭學者提出將MDR1基因轉(zhuǎn)移至大計量化療后無法治愈的腫瘤患者的造血干細胞開展臨床I期的研究。通過臨床I期研究主要想解決幾個問題：①MDR1基因轉(zhuǎn)移至骨髓造血細胞后是否可使CD34＋細胞MDR表達增加；②回輸轉(zhuǎn)染MDR1的細胞后是否可使造血重建；③是否具有長期重建造血的功能；④對于化療引起的骨髓抑制是否具有保護作用。如果I期臨床試驗能獲得令人滿意的結(jié)果，這個方案將進入II期試驗，即加大化療計量，觀察對骨髓的保護效應。除MDR基因外，二氫葉酸還原酶（mDHFR）、MGMT、GST及醛脫氫酶（ALDH）等也被用于腫瘤耐藥基因的研究。