樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的主要功能是吸收抗原，進(jìn)行加工，并向T淋巴細(xì)胞呈遞。其它抗原呈遞細(xì)胞也有此功能，如B淋巴細(xì) 胞和單核細(xì)胞。但是，與其它細(xì)胞不同的是，DC細(xì)胞具有誘導(dǎo)初發(fā)免疫反應(yīng)的獨(dú)特功能，例如，可以活化處女T細(xì)胞（Naive T cell）。DC細(xì)胞存在于外周淋巴組織中，已在血液和非淋巴器官中發(fā)現(xiàn)了不同類型的DC細(xì)胞，并被認(rèn)為是淋巴組織中細(xì)胞的前體。
由于血液和組織 中DC細(xì)胞含量少，且缺乏特異的DC標(biāo)記物，所以DC細(xì)胞的研究非常困難。因此，關(guān)于DC細(xì)胞的了解主要來(lái)自于通過(guò)密度梯度離心、培養(yǎng)、和/或陰性選擇富 集后的DC細(xì)胞的研究。這些過(guò)程利用了DC細(xì)胞的密度和黏附特征，和在一定細(xì)胞因子條件下的選擇性生長(zhǎng)，或缺乏淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的系列標(biāo)記物的 表達(dá)。但是，這些方法中DC細(xì)胞的產(chǎn)率和純度較低，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而且，這些操作可以影響細(xì)胞的功能，并且無(wú)法做DC細(xì)胞含量的定量分析。
最近的報(bào) 告發(fā)現(xiàn)在活化DC細(xì)胞和血液或淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)的DC細(xì)胞表面CD83和CMRF-44高表達(dá)。CD83和CMRF-44可以作為DC細(xì)胞的活化標(biāo)志物， 但在體內(nèi)或未處理的細(xì)胞上沒(méi)有特征性表達(dá)，或表達(dá)水平很低。在對(duì)新鮮分離的DC細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)IL-3Ra在淋巴器官的DC細(xì)胞上有特異表達(dá)。從人類 外周淋巴組織中分離的單個(gè)核細(xì)胞中主要是此類DC細(xì)胞。IL-3Ra（CD123）抗體可以用來(lái)進(jìn)行免疫磁珠分選，從外周淋巴組織制備的單個(gè)核細(xì)胞樣本中，將CD123+ DC細(xì)胞進(jìn)行200倍富集。CD123抗體還可以用來(lái)做免疫組化分析，特異識(shí)別濾泡外T細(xì)胞富集區(qū)的CD123+ DC。在外周血中也有CD123+ DC細(xì)胞，與以前所說(shuō)的CD11c- DC細(xì)胞和CD33dimCD14-CD16- DC細(xì)胞是同一類細(xì)胞。
由于缺乏DC特異性標(biāo)記物，目前仍然不清楚DC是否是自成一系的一類細(xì)胞。DC細(xì)胞既可以由成熟的外周血單核細(xì)胞生成，也可以由未分離的CD34+干祖

細(xì)胞經(jīng)GM-CSF和TNF-a培養(yǎng)得到。使用CD123抗體，發(fā)現(xiàn)有一群CD34+ DC樣幼稚細(xì)胞。這群細(xì)胞與CD34+干祖細(xì)胞的區(qū)別是可以發(fā)育成Langerhan細(xì)胞樣DC。因此，根據(jù)CD123強(qiáng)染，可以識(shí)別出一類人類DC細(xì)胞，它是不同組織間DC細(xì)胞的連接橋梁。
在 外周淋巴組織中還發(fā)現(xiàn)另一個(gè)DC亞群，與CD123+ DC不同的是，其表型為CD11c+HLA-DR+LINdim/-。與CD123+ DC相反，這群DC細(xì)胞位于生發(fā)中心。在血中也含有CD11c+HLA-DR+LINdim/- DC細(xì)胞，與CD33brightCD14dimCD16- DC細(xì)胞是同一類細(xì)胞。
由此可見(jiàn)，DC系統(tǒng)由多種細(xì)胞類型構(gòu)成，發(fā)育途徑不一。但 是，目前對(duì)這些細(xì)胞的功能和可能的特殊性、在生理或病理?xiàng)l件下如何受調(diào)控等方面仍缺乏了解。CD123+ DC和CD11c+ DC細(xì)胞具有不同的表型，在淋巴器官中的位置也不同，提示它們可能有不同的功能。近年來(lái)的研究主要集中在使用DC細(xì)胞進(jìn)行抗腫瘤和抗感染治療方面。不同報(bào) 道證實(shí)，這有可能抑制腫瘤生長(zhǎng)。
使用這些新的DC標(biāo)記物建立起來(lái)的檢測(cè)系統(tǒng)，可以幫助對(duì)新鮮外周血新鮮中的兩類不同的DC細(xì)胞進(jìn)行定量檢測(cè)，同時(shí)可以加以分離。實(shí)驗(yàn)方法采用三色或四色流式細(xì)胞儀分析，檢測(cè)速度快，樣本用量少，可以用來(lái)輔助研究在病理和生理?xiàng)l件下，DC在免疫調(diào)控中作用。

檢測(cè)原理和用具

檢測(cè)原理：
本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菑耐庵苎袡z測(cè)兩種類型的DC細(xì)胞：CD123+ DC（Anti-IL-3Ra+）和CD11c+ DC。CD11c和CD123并不是DC特異的標(biāo)志物。兩類細(xì)胞均HLA-DR高表達(dá)，單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的系列標(biāo)記物弱表達(dá)。因此使用單一熒 光標(biāo)記的LIN cocktail（LIN1）抗體將DC細(xì)胞區(qū)分出來(lái)。LIN1抗體包括CD3、CD14、CD16、CD19、CD20和CD56。
另外，本實(shí)驗(yàn)還可以區(qū)分嗜堿粒細(xì)胞。嗜堿粒細(xì)胞的表型是：LIN1-CD123+HLA-DR-。使用HLA-DR可以區(qū)分嗜堿粒細(xì)胞和CD123+ DC細(xì)胞。

細(xì)胞來(lái)源：
樣本使用EDTA、ACD或肝素鈉抗凝全血，或分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。樣本采集后24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。

試劑：

1. 檢測(cè)DC細(xì)胞用的BDIS熒光標(biāo)記的單克隆抗體。
四色分析：
LIN1 FITC：貨號(hào)340546，含有CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56
CD123 PE（Anti-IL-3Ra）：貨號(hào)340545
Anti-HLA-DR PerCP：貨號(hào)347364
CD11c APC：貨號(hào)340544
Mouse IgG1 PE：貨號(hào)349043
Mouse IgG2a APC：貨號(hào)340473
三色分析：
LIN1 FITC：貨號(hào)340546，含有CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56
CD123 PE（Anti-IL-3Ra）：貨號(hào)340545
CD11c PE：貨號(hào)347637
Anti-HLA-DR PerCP：貨號(hào)347364
Mouse IgG1 PE：貨號(hào)349043
Mouse IgG2a PE：貨號(hào)349053
2. FACS Lysing Solution（10X）：FACS溶血素，貨號(hào)349202，用去離子水1：10稀釋
3. 洗液：PBS緩沖液
4. 1X PBS配制的1%多聚甲醛

設(shè)備用具：
1. EDTA、ACD或肝素鈉真空采血管
2. 12´75mm FALCON試管
3. 振蕩混勻器
4. FACS流式細(xì)胞儀
5. 離心機(jī)
6. 微量加樣器

全血樣本熒光抗體染色步驟：
1. 按照下表在各管中加入適量抗體；

FITC PE PerCP APC
4-Color 四色分析
Tube 1Tube 2LIN1 20uLLIN1 20uL CD123 5u（全血） 10uL（PBMC）Mouse IgG1 Anti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uL CD11c 5uLMouse IgG2a
3-Color 三色分析
Tube 1Tube 2Tube 3Tube 4 LIN1 20uLLIN1 20uLLIN1 20uLLIN1 20uL CD123 5uL（全血） 10uL（PBMC）Mouse IgG1CD11c 5uLMouse IgG2a Anti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uL

2. 每管加入100uL全血，振蕩混勻，室溫暗處反應(yīng)15分鐘；
3. 加入2mL FACS溶血?jiǎng)?，振蕩混勻，室溫暗處放?0分鐘；
4. 300xg離心5分鐘，棄上清；
5. 振蕩混勻，加入1mL洗液；
6. 300xg離心5分鐘，棄上清；
7. 振蕩混勻，加入300uL 1%多聚甲醛；
8. 2-8°C暗處保存，24小時(shí)內(nèi)上機(jī)分析

PBMC樣本熒光抗體染色步驟：
1. 按照上表在各管中加入適量抗體；
2. 每管加入50uL全血，振蕩混勻，暗處冰浴反應(yīng)25分鐘；
3. 輕輕混勻，加入1mL洗液；
4. 300xg離心5分鐘，棄上清；
5. 輕輕混勻，加入300uL 1%多聚甲醛；
6. 2-8°C暗處保存，24小時(shí)內(nèi)上機(jī)分析

數(shù)據(jù)獲取：
1. 使用CaliBRITE微球，做FACSComp，調(diào)整PMT電壓和熒光補(bǔ)償，檢查儀器靈敏度；

2. 上樣：使用CELLQuest軟件，獲取50,000個(gè)細(xì)胞，用FSC設(shè)閾值，排除碎片干擾；
3. 使用CELLQuest軟件分析結(jié)果